正交試驗優(yōu)選紫冬凝膠最佳提取工藝

李錦堂，王賢兒，關(guān)琴笑，譚娥玉，盧穎欣

(1.江門市五邑中醫(yī)院/暨南大學(xué)附屬江門中醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 江門 529000；2.江門市五邑中醫(yī)院 陳皮研究院，廣東 江門 529000；3.廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528400)

紫冬油為我院治療皮膚燒燙傷、小兒濕疹、褥瘡等皮膚疾病的有效制劑，已沿用40余年，深受醫(yī)師推崇、患者好評且產(chǎn)值較大。原方由紫草、忍冬藤、白芷等組成，有清熱解毒、消腫排膿之功，臨床使用發(fā)現(xiàn)也有一定的破損肌膚修復(fù)作用。紫草作為原方君藥，現(xiàn)代研究表明其主要成分紫草素、紫草寧及其衍生物為萘醌類化合物，具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤活性等作用[1-3]。但因原方提取需經(jīng)油炸提取后與蜂蠟、麻油等混合制成，制備工藝繁瑣，且現(xiàn)代研究表明，在成分提取方面存在一些弊端，因此為提高制劑效能，方便患者使用，本課題將在保持中醫(yī)藥特色的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代制劑研究方法，對該制劑進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，以水凝膠作為劑型基質(zhì)，以期將其改進(jìn)成為既保持療效又方便臨床使用的新劑型——紫冬凝膠。本實驗將采用正交試驗研究方法，對該制劑的提取方法進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

LQ-C20002電子天平(五鑫衡器有限公司)；ME104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(北京普析通用有限責(zé)任公司)；WH-800超聲波清洗機(jī)(濟(jì)寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HH-3A數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)。

1.2 藥品與試劑

新疆紫草(1710001)(廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司)；忍冬藤(161101)(安徽匯仁堂中藥飲片有限公司)；白芷(20170301)(國藥集團(tuán)馮了性(佛山)藥材飲片有限公司)；左旋紫草素對照品(0769-9903)(中國食品藥品檢定研究院)；95%乙醇(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；蒸餾水(實驗室自制)。

2 方法及結(jié)果

2.1 總萘醌測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定左旋紫草素對照品4.20 mg，加95%乙醇使溶解，并定容至10 mL，搖勻，即得濃度為0.42 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取處方藥1份粉碎，精密稱定，加入8倍量70%乙醇，超聲30 min，過濾，分別取濾液10 mL，揮干乙醇，置于烘箱中60 ℃烘干4 h，放冷，稱重。另分別精密吸取0.5 mL濾液于20 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，得到供試品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇 精密移取上述制備的對照品溶液、供試品溶液各1 mL，分別置入10 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，定容，搖勻。隨行試劑為空白對照組，照紫外-可見分光光度法于400～600 nm波長范圍全程掃描。結(jié)果對照品及供試品均在516 nm處有最大吸收，且空白試劑對照均無干擾，故選擇516 nm為測定波長。結(jié)果見圖1-圖3。

圖1 左旋紫草素紫外吸收光譜

圖2 供試品紫外吸收光譜

圖3 陰性對照試驗紫外吸收光譜

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取濃度為0.42 mg/mL對照品溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，置于25 mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定。以左旋紫草素對照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算得回歸方程：A=19.608c+0.003 8(r=0.999 9)，結(jié)果表明，供試品溶液濃度在0.005 04～0.050 4 mg/mL范圍內(nèi)，其吸收度線性關(guān)系良好。

2.2 提取方法的選擇和單因素考察

2.2.1 權(quán)重系數(shù)法 以羥基萘醌總色素的含量和浸膏得率為綜合指標(biāo)進(jìn)行評分，由于主要考察君藥——紫草有效成分的提取工藝，羥基萘醌總色素的含量更為重要，因此，羥基萘醌總色素含量與浸膏得率的權(quán)重比為7∶3。

2.2.2 提取方法的選擇 根據(jù)實際生產(chǎn)條件，對醇回流法、醇超聲法、醇浸漬法3種方法進(jìn)行優(yōu)選確定，測定在不同提取方法下總萘醌的含量及浸膏得率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，有效成分羥基萘醌總色素的含量在醇回流提取條件下最低；浸膏得率約在4%～6%之間，3種方法相差不大；采用“2.2.1”項下的權(quán)重系數(shù)評分法，3種方法評價得分由高至低：乙醇超聲法>乙醇浸漬法>乙醇回流法。根據(jù)實驗結(jié)果，醇浸漬法和醇超聲法評價得分相近，結(jié)合實際生產(chǎn)效率，最終選擇醇超聲法作為本研究的基本提取方法。

2.2.3 單因素考察 按“2.1.3”項的測定方法以及“2.2.2”項下篩選的提取方法，進(jìn)行單因素水平考察，最終以乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)設(shè)置L9(34)正交實驗因素水平表(如表2)，實驗研究發(fā)現(xiàn)超聲提取溫度應(yīng)控制在(60±3)℃。

2.2.4 正交試驗 以“2.2.3”項下L9(34)表進(jìn)行正交試驗，以羥基萘醌總色素含量及浸膏得率為綜合指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見正交試驗分析表3和方差分析表4。

表1 不同提取方法的實驗結(jié)果

表2 正交試驗因素水平

2.2.5 正交試驗結(jié)果與方差分析 由表4可知，因素的主次為A>B>C>D，因素A、B有顯著性差異，因素C、D沒有顯著性差異。結(jié)合極差分析，基于實驗的效率及節(jié)約溶劑、時間、節(jié)能等方面的考慮，最終確定提取的最佳條件為A1B3C1D1，即70%乙醇、料液比1∶12、提取45 min、提取1次。

表3 正交試驗結(jié)果分析

表4 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19.000，*顯著性。

2.2.6 提取工藝驗證 取處方藥各3份，粉碎，精密稱定，加入12倍量70%乙醇，超聲45 min，過濾，分別取濾液10 mL，揮干乙醇，再置于烘箱中65℃烘干4 h，放冷，稱重。另分別精密吸取0.5 mL濾液于20 mL容量瓶中，分別加入70%乙醇定容至刻度，得到供試品溶液。

按“2.1.2”和“2.1.3”項的方法，測定在最佳提取工藝下羥基萘醌總色素的含量及浸膏得率，結(jié)果見表5。

表5 最佳提取工藝驗證

結(jié)果顯示，羥基萘醌總色素平均含量為11.17 mg，RSD%為1.42%；浸膏得率平均為6.66%，RSD%為2.57%，表明正交試驗優(yōu)選條件具有較強(qiáng)的可操作性及穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 有效成分含量測定方法的選擇

紫冬凝膠原劑型為以蜂蠟和麻油等制成的油劑，由于自身使用的缺陷而被改進(jìn)為水凝膠劑，該制劑為院內(nèi)制劑，用量大，產(chǎn)值高，值得進(jìn)一步研發(fā)。本實驗根據(jù)實際情況，采用紫外分光光度法作為該制劑的含量測定方法，可操作性強(qiáng)、方法簡單高效，亦可為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供研究數(shù)據(jù)，方便日后藥檢工作。

3.2 溫度對有效成分的影響

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，用乙醇回流法對紫草進(jìn)行提取時，加熱到一定溫度，提取液顏色會由紅色變成紫黑色，其供試品溶液的紫外吸收圖譜在516nm處沒有吸收峰，表明紫草中萘醌類色素在一定溫度下會發(fā)生改變，對熱不穩(wěn)定，因此也提示對該制劑的生產(chǎn)過程中應(yīng)注意溫度的控制。本次實驗發(fā)現(xiàn)，醇回流80℃時，紫草中萘醌類色素已處于不穩(wěn)定的狀態(tài)。在對乙醇超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化的過程中，考察了紫草在30～70℃乙醇超聲環(huán)境下的萘醌類總色素含量，結(jié)果表明隨著溫度的升高，紫草中羥基萘醌總色素含量與浸膏得率均有增加；同時表明紫草中萘醌類總色素在70℃時仍可穩(wěn)定存在。李曉瑾等[4]研究表明紫草素在50～70 ℃范圍內(nèi)的影響很小，在超過80 ℃后，紫草素含量快速降低。因此建議提取時候?qū)囟确€(wěn)定在79℃以下，本實驗過程控制在(60±3) ℃。

3.3 提取方法的選擇

在考察最佳提取方法的實驗中，乙醇浸漬法綜合評分雖稍低于乙醇超聲法，但實際差別不大。乙醇浸漬法除去耗時這一缺點，在穩(wěn)定性上比起乙醇超聲法有較大的優(yōu)勢，且更節(jié)約能源，因此在時間充裕的條件下還可對乙醇浸漬法進(jìn)行更加全面深入的研究。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5]可知，紫草素具有光不穩(wěn)定性，且因羥基的存在，易被氧化，長時間置于空氣中，紫草素的含量會下降。本課題的實驗過程均沒有在避光條件下進(jìn)行，但在實驗過程中，對密封無避光放置2天之后的紫草藥液再次進(jìn)行含量測定，對比發(fā)現(xiàn)羥基萘醌總色素含量無明顯變化，故未采取避光的操作。實驗中，超聲過程均在密封條件下，且過濾與取樣的時間較短，受氧化的影響較低，但在實際生產(chǎn)工作中，應(yīng)避免長時間暴露于空氣中。