新型雙鹵代吡啶酰腙的合成及生物活性研究

雷渭輝, 劉向榮, 楊再文, 趙順省

(西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710054)

酰腙類化合物是一類特殊的Schiff堿類化合物，是由酰肼中伯胺氮原子與醛或酮的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)縮合而成，其分子結(jié)構(gòu)中含有生物活性基團(tuán)(CO—NH—N=CH)，具有抗腫瘤、抗菌、消炎鎮(zhèn)痛、殺蟲、抑菌等多種生物活性，因此其在農(nóng)藥與醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。其中，含吡啶類酰腙相比于只含苯環(huán)類酰腙往往具有更高的生物活性[4-5]。如曾凡付等[6-9]合成了含有芳香基團(tuán)的酰腙類化合物，對(duì)菜粉蝶幼蟲具有較強(qiáng)的觸殺活性和胃毒活性，且其結(jié)構(gòu)中含有吡啶環(huán)的酰腙體現(xiàn)出更強(qiáng)的殺蟲活性。另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，通過將鹵素引入到酰腙化合物中能有效提高化合物的生物活性，這是由于鹵素具有增加分子親脂性，從而提高對(duì)脂質(zhì)膜滲透性，另外鹵素的電負(fù)性可以增加中心分子生物活性等特點(diǎn)[11]。因此，含鹵素酰腙化合物通常具有良好的生物活性[12-14]，并被廣泛用作殺蟲、殺菌劑。例如，梁芳珍[15]等合成了含溴元素的酰腙化合物5-溴水楊醛硫代雙酰腙，當(dāng)其濃度為1%和0.1%時(shí)其對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌及金黃色葡萄球菌具有一定抑菌性。5-氯水楊醛水楊酰腙相比于不含氯元素的水楊醛水楊酰腙對(duì)辣椒疫霉菌、煙草赤星菌和棉花枯萎菌均有較好的抑制作用。研究[16-17]合成了水楊醛-4-氯苯甲酰腙釩配合物以及2-硝基-5-呋喃苯甲醛-4-氯縮氨基脲酰腙，由于兩個(gè)化合物中均含有氯元素，兩個(gè)化合物均對(duì)錐蟲和利什曼原蟲有著較好的殺蟲活性。

綜上所述，若同時(shí)將吡啶環(huán)、鹵素以及生物活性基團(tuán)(CONHN=CH)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)3類活性基團(tuán)的疊加，有望得到具有特殊生物活性的新化合物。

本文以2-氯吡啶-4-甲酸甲酯(1)和水合肼為原料合成了2-氯吡啶-4-甲酰肼(2)， 2與鹵代(F， Cl， Br)對(duì)苯甲醛反應(yīng)得到3種新型雙鹵代吡啶酰腙[C13H9N3OFCl(3a)， C13H9N3OCl2(3b)和C13H9N3OClBr(3c)]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和元素分析表征。利用紫外光譜研究了3a～3c與ct-DNA的作用模式；采用熒光光譜研究了3a～3c與BSA的作用方式；通過瓊脂擴(kuò)散法研究了3a～3c對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌的抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WRS-2型熔點(diǎn)儀；TU-1900型紫外分光光度計(jì)；LS-55型熒光光譜儀；Bruker Avance-400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker TensorⅡ型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片)；PE-2400-Ⅱ型元素分析儀。

ct-DNA, Sigma公司,生物純;BSA,北京百靈威科技有限公司,生物純；2-氯吡啶-4-甲酸甲酯，上海百舜生物科技有限公司；水合肼(80%)，天津富宇精細(xì)化工有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 2的合成

在圓底燒瓶中加入1 5.16 g(30 mmol)和無(wú)水乙醇(30.00 mL)，加熱攪拌使其溶解；加入80%水合肼(3.64 mL)，回流(80 ℃)反應(yīng)3 h。冷卻至室溫，析出大量無(wú)色透明晶體，過濾，濾餅烘干，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶得白色固體2，收率78%, m.p.172.01～173.31 ℃;1H NMRδ: 10.19(s, 1H, NH), 8.56～7.74(m, 3H, PyH), 4.67(s, 2H, NH2);13C NMRδ: 162.81, 151.34, 151.17, 144.29, 122.14, 121.05; Anal. calcd for C6H6N3OCl: C 42.00, H 3.52, N 24.49， found C 42.06, H 3.09, N 24.00。

(2) 3a～3c的合成(以3a為例)

在圓底燒瓶中加入2 0.17 g(1 mmol)和甲醇(10 mL)，攪拌使其溶解；緩慢加入4-氟苯甲醛107 μL(1 mmol)，加畢，回流(65 ℃)反應(yīng)4 h。冷卻至室溫，析出大量白色固體，濾餅過濾，烘干得白色固體3a，收率82%, m.p.208.3～209.4 ℃;1H NMRδ: 12.15(s, 1H, NH), 8.62～7.75(m, 3H, PyH), 8.45(s, 1H, N=CH), 7.83～7.33(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 165.08, 162.61, 160.68, 151.32, 148.78, 144.49, 130.95, 130.02, 122.68, 121.72, 116.38; IRν: 3470, 1669, 1598, 1534, 1237, 1138 cm-1; Anal. calcd for C13H9N3OFCl: C 56.23, H 3.27, N 15.13, found C 56.35, H 2.61, N 14.85。

用類似的方法合成3b和3c。

Scheme 1

3b： 白色固體，收率81%, m.p.218.5～220.1 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H, NH), 8.64～7.78(m, 3H, PyH), 8.44(s, 1H, N=CH), 7.85～7.56(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 160.75, 151.33, 148.59, 144.41, 135.47, 133.28, 129.46, 128.97, 122.70, 121.73; IRν: 3443, 1687, 1589, 1540, 1291, 1165 cm-1; Anal. calcd for C13H9N3OCl2: C 53.09, H 3.08, N 14.29, found C 53.20, H 2.53, N 14.00。

3c： 白色固體，產(chǎn)率84%, m.p.228.3～228.8 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H, NH), 8.63～7.68(m, 3H, PyH), 8.42(s, 1H, N=CH), 7.83～7.71(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 160.76, 151.33, 148.68, 144.42, 133.62, 132.42, 129.67, 124.31, 122.70, 121.73; IRν: 3452, 1673, 1594, 1542, 1273, 1174 cm-1; Anal. calcd for C13H9N3OClBr: C 46.12, H 2.68, N 12.41, found C 46.16, H 2.09, N 12.12。

1.3 3a～3c與ct-DNA的相互作用

在參比比色皿中加入3 mL現(xiàn)配制的0.01 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.9)，同時(shí)向樣品比色皿中加入等體積現(xiàn)配制的1×10-4mol·L-1化合物溶液，首先掃描基線，之后用微量進(jìn)樣器分別向參比比色皿和樣品比色皿中加入50 μL 100 mg·mL-1的ct-DNA溶液，連續(xù)加入6次，每次間隔5 min，使其充分混合，掃描波長(zhǎng)范圍為250～500 nm。

在溫度恒定為(25±0.1) ℃的水浴鍋中測(cè)定化合物與ct-DNA混合溶液的粘度。首先將25 mL的0.01 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液加入粘度計(jì)中，記錄緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間，清洗粘度計(jì)后，加入用緩沖溶液配制的濃度為1×10-4mol·L-1ct-DNA溶液25 mL，再次記錄ct-DNA流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間。最后加入等體積(50 μL/次)的濃度為1×10-4mol·L-1的化合物溶液，連續(xù)7次，記錄每次混合液流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間。每組做3次平行實(shí)驗(yàn)，求平均值，由溶液的相對(duì)粘度公式作圖[18]。

1.4 3a～3c與BSA的相互作用

配制0.01 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.2)，再用現(xiàn)制的Tris-HCl緩沖液配制1×10-5mol·L-1的化合物溶液和1×10-7mol·L-1的BSA溶液。取3 mL BSA溶液，加入到比色皿中，開始掃描，然后逐次向比色皿中加入等體積(30 μL/次)的化合物溶液，待樣品與BSA相互作用3 min后開始測(cè)試，連續(xù)滴加6次。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.5 3a～3c的抑菌性能測(cè)試

利用瓊脂擴(kuò)散法[19]研究了3種酰腙化合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性。采用LB培養(yǎng)基，以DMSO作為空白對(duì)照組。用DMSO配制得到2 mg·mL-1的化合物3a～3c溶液，為確定3a～3c的最小抑菌濃度，采用二倍稀釋法將溶液稀釋至1 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1。采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量透明抑菌圈的平均直徑。抑菌圈的平均直徑>8 mm，可判定有抑菌作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征(以3a為例)

3a的1H NMR譜圖表明，δ12.15處的特征峰為3a的酰胺NH吸收峰，δ8.62～7.75處特征峰為吡啶環(huán)的吸收峰，δ8.45處特征峰為腙N=CH吸收峰，且NH和N=CH質(zhì)子峰均為單峰，苯環(huán)特征峰位于δ7.83～7.33間?？煽闯?a以酮式結(jié)構(gòu)存在。

3a的13C NMR譜圖表明，δ148.78處的碳原子為3a腙N=CH碳原子，酰胺C=O處碳原子位移由2中的δ162.81變?yōu)?a中的δ162.61。

表1 3a～3c與ct-DNA的結(jié)合參數(shù)Table 1 Binding parameters of 3a～3c with ct-DNA

3a的IR分析顯示，3470 cm-1處吸收峰屬于酰胺N—H伸縮振動(dòng)峰，1669 cm-1處吸收峰屬于酰胺C=O伸縮振動(dòng)峰，1598 cm-1處吸收峰屬于腙C=N伸縮振動(dòng)峰，1534 cm-1處的吸收峰屬于吡啶環(huán)C=N的吸收峰，1237 cm-1處的吸收峰屬于酰胺C—N伸縮振動(dòng)峰，1138 cm-1處的吸收峰屬于吡啶環(huán)C—N伸縮振動(dòng)峰。

2.2 生物活性

(1) 3a～3c與ct-DNA的相互作用

以3a為例，3a與ct-DNA相互作用的紫外光譜圖如圖1所示，3a～3c的cDNA/(εa-εf)與cDNA關(guān)系見圖2。紫外光譜可以用來研究酰腙化合物與ct-DNA相互作用的方式[20]，若發(fā)生減色效應(yīng)說明化合物是以插入的方式與ct-DNA相互作用。這是由于化合物本身存在的空π*軌道與ct-DNA發(fā)生耦合而填充部分電子，導(dǎo)致π-π*躍遷概率下降，從而出現(xiàn)減色效應(yīng)；此外，由于化合物插入ct-DNA后，長(zhǎng)鏈ct-DNA分子的“屏蔽”作用使得π平面的通光量減少，也會(huì)出現(xiàn)減色效應(yīng)[21]。

由化合物與ct-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb計(jì)算公式[22]，得到擬合直線，Kb即為直線斜率和截距之比，擬合結(jié)果列于表1中。

λ/nm圖1 化合物3a與ct-DNA作用的紫外光譜圖Figure 1 UV spectra of interaction between compound 3a with ct-DNA

從圖1可以看出，隨著ct-DNA濃度的增加，吸光度逐漸減小，3a在299 nm處出現(xiàn)減色效應(yīng)。3b、 3c在305.5 nm、 308 nm處也出現(xiàn)了類似的減色效應(yīng)，由此可以判斷3a～3c均是以插入的模式與ct-DNA相互作用。由表1可以看出，3a～3c與ct-DNA的結(jié)合常數(shù)依次為5.14×106、 1.87×107和9.93×106L·mol-1，可看出3a～3c與DNA的結(jié)合能力均較強(qiáng)[23]，并且3b的結(jié)合常數(shù)大于3a和3c，表明3b與ct-DNA的結(jié)合能力更強(qiáng)。

cDNA/10-4(mol·L-1)圖2 3a～3c的cDNA/(εa-εf)與cDNA關(guān)系圖Figure 2 Plot of cDNA/(εa-εf) against cDNA of 3a～3c

圖3為3a～3c的(η/η1)1/3與ccompound/cDNA關(guān)系圖。從圖3中可以看出，隨著3a～3c的濃度的增加，化合物與ct-DNA混合溶液的相對(duì)粘度升高，這是由于為了容納3a～3c， ct-DNA相鄰堿基對(duì)間的距離增大，雙螺旋長(zhǎng)度增長(zhǎng)，導(dǎo)致混合溶液的粘度增加[24]。說明3a～3c均以插入方式與ct-DNA作用，這與紫外光譜得出的結(jié)論一致。

(2) 3a～3c與BSA的相互作用

熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅是猝滅劑與BSA形成了復(fù)合物，而動(dòng)態(tài)猝滅是兩者發(fā)生相互碰撞造成的，可用Stern Volmer和Lineweaver-Burk方程[25-26]來描述。

表2 3a～3c與BSA的動(dòng)態(tài)熒光猝滅參數(shù)Table 2 Dynamic fluorescence quenching parameters of 3a～3c with BSA

表3 3a～3c與BSA的靜態(tài)熒光猝滅參數(shù)Table 3 Static fluorescence quenching parameters of 3a～3c with BSA

ccompound/cDNA圖3 3a～3c的(η/η1)1/3與ccompound/cDNA關(guān)系圖Figure 3 Plot of (η/η1)1/3 against ccompound/cDNA of 3a～3c

以3a為例，3a與BSA相互作用的熒光曲線和3a～3c與BSA作用的結(jié)合曲線圖分別見圖4和圖5。如圖4所示，隨著化合物濃度增大，熒光猝滅的峰形和位置基本保持不變，但熒光強(qiáng)度呈梯次下降，在340 nm左右發(fā)生熒光猝滅，說明3a與BSA發(fā)生了相互作用。3b，3c與BSA作用發(fā)生熒光猝滅的峰形和位置與3a相似。

假設(shè)兩者是動(dòng)態(tài)猝滅的過程。根據(jù)Stern Volmer，對(duì)Q和F0/F進(jìn)行線性擬合，擬合結(jié)果見表2。由表2可知，猝滅速率常數(shù)Kq大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·s-1)，表明酰腙化合物與BSA的相互作用并不是由分子碰撞引起的，而是形成了復(fù)合物。

根據(jù)Lineweaver-Burk，以lg[Q]對(duì)lg[(F0-F)/F]進(jìn)行線性擬合，得到圖5，斜率為n，截距為lgKA。擬合結(jié)果列于表3，可以看出，3a～3c與BSA均以近似1/1形成了復(fù)合物，表明酰腙化合物可以在生物體內(nèi)被蛋白質(zhì)運(yùn)輸與儲(chǔ)存[27]。3a～3c與BSA的結(jié)合常數(shù)KA分別為1.87×103、 9.77×107、 9.37×104L·mol-1，KA(3b)>KA(3c)>KA(3a)，表明氯代酰腙化合物3b較其他兩種鹵代化合物3a和3c與BSA的結(jié)合能力更強(qiáng)。

λ/nm圖4 3a與BSA作用的熒光曲線Figure 4 The fluorescence curves of interaction between 3a and BSA

(3) 3a～3c的抑菌活性研究

表4為DMSO和3a～3c對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈數(shù)據(jù)，抑菌順序?yàn)榇竽c桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌。由表4可以看出，3a～3c相對(duì)于空白對(duì)照組均對(duì)4種細(xì)菌有一定抑菌能力。同一濃度下，3a對(duì)4種細(xì)菌的抑菌能力不斷減弱，3b對(duì)4種細(xì)菌的抑菌能力先增強(qiáng)后減弱，3c對(duì)4種細(xì)菌的抑菌能力不斷增強(qiáng)，且3a相對(duì)于3b， 3c的抑菌能力最強(qiáng)，這是由于在生物體內(nèi)，含氟化合物對(duì)膜、組織等具有較強(qiáng)的滲透力，提高了含氟化合物在生物體內(nèi)的吸收和傳遞速度[28]。同一化合物對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果不同，3a對(duì)大腸桿菌的抑菌能力最強(qiáng)，3b對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌能力最強(qiáng)，3c對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌能力最強(qiáng)。隨著化合物濃度降低，3a～3c的抑菌能力不斷降低。在化合物濃度為2 mg·mL-1時(shí)，3a對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈直徑依次為10.97、 10.92、 10.90和10.89 mm。在化合物濃度為0.25 mg·mL-1時(shí)，3a～3c對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈直徑接近于空白對(duì)照組的抑菌圈直徑，因此3a～3c的最小抑菌濃度為0.25 mg·mL-1。

表4 DMSO和3a～3c對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈數(shù)據(jù)Table 4 The date of inhibition zones of DMSO and 3a～3c against four kinds of bacteria

lg[Q]圖5 3a～3c的lg[Q]與lg[(F0-F)/F]的關(guān)系曲線Figure 5 Plot of lg[(F0-F)/F] against lg[Q] of 3a～3c

合成了3種新型雙鹵代吡啶酰腙(3a～3c)。 3a～3c均是以插入方式與ct-DNA產(chǎn)生相互作用；化合物與BSA通過靜態(tài)猝滅的方式形成復(fù)合物；3a～3c與ct-DNA， BSA的結(jié)合強(qiáng)度關(guān)系為：3b>3c>3a。 3a～3c對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌4種細(xì)菌均有一定的抑菌能力。其中3a對(duì)4種細(xì)菌的抑菌能力最強(qiáng)。