基于UHPLC-MS/MS法，中毒量氯化琥珀膽堿在大鼠體內(nèi)分布的研究

盛 潔，姜 榮，文繼月，陳 林，解啟文，方俊杰，萬 陽，秦 明，李 婧，陳冠軍，陳志武

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽，合肥 230032；2.安徽省公安廳物證鑒定中心，安徽 合肥 230061；3.安徽醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心，安徽 合肥 230032)

氯化琥珀膽堿(succinylcholine chloride，Suc)又稱司可林、氯化琥珀酰膽堿等，化學(xué)名為二氯化2,2′-[(1,4-二氧代-1,4-亞丁基)雙(氧)]雙[N,N,N-三甲基乙銨]二水合物。Suc在臨床上用作為手術(shù)時的肌肉松弛劑，但若超量注射或在無呼吸機(jī)配合使用的情況下，可致患者呼吸麻痹，甚至死亡[1]。因此，Suc不僅是一種藥物，還是一種有毒化學(xué)品，危險類別為6.1 (b)[2]。近年來，犯罪分子將Suc用于飛鏢射殺家禽、家畜類動物，甚至用作射殺人的毒藥[3]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測出體內(nèi)的Suc成為當(dāng)今司法實踐中的一個新課題。

目前，檢測Suc有高效液相色譜法[4]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5]，離子色譜法[6]、酶電極法[7]等方法，這些方法雖可準(zhǔn)確地檢測體外的Suc，但Suc一旦進(jìn)入體內(nèi)被很快代謝分解成膽堿和琥珀酸，大約只有2%以原形存在，濃度極低，而且代謝產(chǎn)物膽堿也可由體內(nèi)的乙酰膽堿分解產(chǎn)生，琥珀酸也是機(jī)體中的一種內(nèi)源性物質(zhì)[8]，這些檢測方法難以進(jìn)行體內(nèi)的Suc中毒的鑒定且靈敏度較低；或者采用柱后反應(yīng)生成膽堿過氧化物的衍生化方法，但過程較為復(fù)雜[9]。目前主流方法側(cè)重于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]。本研究根據(jù)Suc的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征建立了專屬于Suc的超高效液相色譜-質(zhì)譜法(ultra high performance liquid chromatography-tandem massspectrometry, UHPLC-MS/MS)[11]，為了提高分析測定的精密度和準(zhǔn)確度，采用Oasis WCX固相萃取柱進(jìn)行純化檢測樣品；為了提高方法的靈敏度和檢測速度，選擇Phenomene Luna NH2柱進(jìn)行樣品的色譜分離。按照分析方法驗證要求，對上述方法進(jìn)行了嚴(yán)格的方法學(xué)確證，相較于現(xiàn)有的檢測手段，該方法能快速、準(zhǔn)確地測定Suc中毒大鼠體內(nèi)的藥量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1儀器 30AD超高效液相色譜系統(tǒng)(DGU-20A5R在線真空脫氣機(jī)、LC-30AD泵、SIL-30AC自動進(jìn)樣器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、CTO-20AC色譜柱柱溫箱)，由日本島津(SHIMADZU)公司出品；TRIPLE QUADAPTM5500三重四極桿質(zhì)譜儀，由美國AB公司出品。

1.1.2藥品與試劑 Suc，為白色結(jié)晶性粉末，購自上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，批號：ES8621-4-P1，純度為99%；乙腈和甲醇，購自美國Sigma公司，均為色譜純，批號分別為WXBC7599V和WXBC7987V，純度為98%；甲酸，購自北京百靈威科技有限公司，為色譜純，批號：L240T13，純度為98%；5%氨水，購自合肥英博生物有限公司，批號：20180501。

1.1.3實驗動物 健康SD大鼠(清潔級)，♂，體質(zhì)量(180～220)g，全部是安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為scxk(皖)2017-001，實驗室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為(22±3) ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1Suc中毒大鼠的制備 大鼠背部脫毛后，隨機(jī)分成生理鹽水 (NS) 對照組、Suc 0.75、1.5和3.0 mg·kg-13個劑量組，共4組，每組6只大鼠。各組大鼠分別皮下注射各劑量的Suc和等體積的NS，4 h后，存活的大鼠處死，采集各大鼠血液備用；然后進(jìn)行大鼠尸體解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸及肌肉等臟器組織，置-80 ℃保存。

另取一批大鼠，分別皮下注射NS和0.75 mg·kg-1Suc，4 h后，取腎臟在室溫下放置不同時間后，進(jìn)行腎組織中Suc穩(wěn)定性的檢測。

1.2.2Suc的大鼠急性毒性實驗 取大鼠60只，背部脫毛后，隨機(jī)分為6組，每組10只，各組大鼠分別按劑量1.84、1.66、1.50、1.35、1.21、0 mg·kg-1皮下注射Suc，觀察并記錄給藥后2 h內(nèi)大鼠死亡數(shù)(腹式呼吸消失)，按照改良寇氏法進(jìn)行計算。

1.2.3樣品處理

1.2.3.1血樣品處理 將上述取得的血樣品立即4 000 r·min-1離心10 min，制成血清后置-80 ℃保存。實驗時，取血清0.2 mL，加入2倍體積的乙腈，渦旋震蕩2 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待UHPLC-MS/MS法測試分析。

1.2.3.2組織樣品處理 分別取上述1.2.1制備的各組織樣品0.1 g，用濾紙吸去殘留血液并用超純水沖洗3次，再用濾紙吸去殘留水分，加1 mL超純水用勻漿器進(jìn)行研磨90 s后加入2倍體積的乙腈使其完全沉淀，渦旋震蕩2 min，超聲10 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清0.5 mL過活化后的固相萃取WCX柱，在WCX柱中依次加入5%氨水溶液3 mL和100%甲醇清洗液3 mL清洗，再加入含2%甲酸的甲醇溶液3 mL進(jìn)行洗脫，收集流下的液體，氮氣吹干，加入0.3 mL的水-乙腈溶液(150 ∶150，V∶V)溶解，渦旋，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待UHPLC-MS/MS法測試分析。

1.2.4色譜條件及優(yōu)化 Suc不溶于乙醚，易溶于水，水溶液呈酸性，文獻(xiàn)報道[12]采用Acquity UPLCTMBEH HILIC色譜柱，雖可分離藥物，但出峰時間較慢，本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)選用Phenomene Luna NH2柱，靈敏度高，出峰時間快，可快速檢測出藥物。因此，本研究采用了Luna NH2 柱(2 mm×100 mm, 3 μm，Phenomenex公司)作為色譜柱；同時考察了流動相和流速的影響，由于鹽類物質(zhì)容易導(dǎo)致色譜柱堵塞，易污染，所以選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相；流動相的流速為0.2 mL·min-1時，出峰時間短，并且色譜峰響應(yīng)值與流速為0.1 mL·min-1時無明顯差異，所以流速采用0.2 mL·min-1。柱溫是37 ℃，進(jìn)樣時間為5min。在該條件下出峰時間快，峰型好，響應(yīng)值和分離度高。

1.2.5質(zhì)譜分析條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描下多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，噴霧電壓是5 500 V，霧化氣溫度為500 ℃，氣簾氣體壓力為35 psi。由于氯化琥珀膽堿為雙電荷離子[M]2+，所以一級母離子是145.1，兩個離子對m/z:145.1→115.4，m/z:145.1→93.3，碰撞能分別為16 V和19 V，去簇電壓均為54 V，其中m/z:145.1→115.4的響應(yīng)值高，作為定量離子對。

血及各組織樣品經(jīng)上述優(yōu)化的超高效液相色譜分離后的質(zhì)譜法測定數(shù)據(jù)由Analyst1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)(AB公司)處理，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算Suc含量。

1.2.6方法學(xué)驗證 依據(jù)FDA關(guān)于分析方法驗證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗證，分別對方法的選擇性、線性范圍與檢測限、精密度與準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)以及穩(wěn)定性等方面進(jìn)行考察。

1.2.6.1方法的選擇性 分別取空白血清0.2 mL、空白血清加標(biāo)準(zhǔn)品0.2 mL，按照步驟1.2.3項方法操作，得色譜圖，見Fig 1。結(jié)果表明，大鼠內(nèi)源性物質(zhì)對Suc的測定不產(chǎn)生干擾。

1.2.6.2線性范圍和檢測限 分別配制系列濃度血清標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照1.2.3項方法操作處理，上機(jī)分析，以血清中Suc濃度為橫坐標(biāo)，Suc峰面積為縱坐標(biāo)做線性回歸，得到血清中Suc回歸方程為y=1.483 01e5x+16 493.54(r=0. 997 4)，線性范圍是0.03～1 000 μg·L-1，以S/N≥10確定本方法的最低定量下限是0.03 μg·L-1，以S/N≥3確定本方法的最小檢測限為0. 01 μg·L-1。

1.2.6.3精密度與準(zhǔn)確度 分別用大鼠血清配制低、中、高3個濃度(0.5、20、80 μg·L-1)的樣品，每個濃度進(jìn)行6個樣本分析，連續(xù)測定5 d，根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)曲，分別計算樣品濃度，以其標(biāo)示濃度為參照，按方差分析方法計算測定方法的準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度，見Tab 1。結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，日內(nèi)、日間精密度均小于15%，準(zhǔn)確度為-8.0～9.7。

1.2.6.4回收率 取空白血清0.2 mL，添加不同量的Suc標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成低、中、高 3個濃度(0.5、20、80 μg·L-1)的樣品，每一濃度平行6個樣品，按照線性方程計算回收率，見Tab 1。結(jié)果表明，本方法具有良好的回收率。

Fig 1 Selectivity of method (UHPLC-MS/MS method)A～B: The chromatogram of blank serum. In the map, red curve and blue curve indicate qualitative and quantitative measurements, respectively; C～D: The chromatogram of blank serum spiked with Suc at 20 μg·L-1.

Tab 1 Results of recoveries, matrix effects, precision and accuracy for Suc in rat n=6)

1.2.6.5基質(zhì)效應(yīng) 取空白血清0. 2 mL，配制成低、中、高 3 個濃度( 0.5、20、80 μg·L-1)的樣品,每一濃度平行 6 個樣品，得到Suc的峰面積A1，測得3個濃度樣品的峰面積為A2?；|(zhì)效應(yīng)M=A1/A2×100%，計算結(jié)果見Tab 1。結(jié)果表明，該方法不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

1.2.6.6穩(wěn)定性 取空白血清0. 2 mL，配制成低、中、高3個濃度( 0.5、20、80 μg·L-1)的樣品，每一濃度平行3個樣品，分別考察上述樣本在4 ℃保存24 h、反復(fù)凍融3次，以及-80 ℃冷凍保存兩個月的穩(wěn)定性，見Tab 2，結(jié)果顯示，該樣品具有良好的穩(wěn)定性。

Tab 2 Results for stability of Suc in different

2 結(jié)果

2.1 Suc致大鼠中毒情況在皮下注射4 h內(nèi)，NS對照組和Suc 0.75 mg·kg-1組的6只大鼠均未出現(xiàn)死亡，1.5和3.0 mg·kg-1組的6只大鼠中分別有3只和6只死亡。Suc的大鼠急性毒性實驗結(jié)果顯示，Suc的LD50為1.59 mg·kg-1。

2.2 中毒大鼠血清中Suc濃度結(jié)果如Fig 2A和2B所示，NS對照組大鼠血清中未出現(xiàn)Suc的定性及定量色譜峰，表明在該組大鼠血清中未檢測到Suc；但Suc給藥各劑量組大鼠血清中均出現(xiàn)了Suc的定性和定量色譜峰，并且在0.75 ～ 3.0 mg·kg-1范圍內(nèi)，增大給藥劑量，大鼠血清中Suc濃度顯著增高。

2.3 中毒大鼠臟器中Suc的分布情況NS對照組大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸及肌肉等臟器組織中均沒有檢測到Suc。Fig 3表明在0.75 mg·kg-1組大鼠除心、脾及腸組織外的上述臟器組織中檢測到了Suc；在1.5和3.0 mg·kg-1兩組大鼠的上述各臟器組織中都檢測到了Suc。這與血清中的檢測結(jié)果相似，在0.75～3.0 mg·kg-1范圍內(nèi)，隨著給藥中毒劑量的增大，大鼠各器官組織中Suc含量明顯地增高，呈數(shù)倍甚至數(shù)十倍的增加。在0.75、1.5和3.0 mg·kg-13個劑量組的大鼠各臟器組織中，腎臟中Suc含量均為最高，與其它組織比較，有明顯的差異。

2.4 腎組織中Suc檢測的穩(wěn)定性大鼠皮下注射NS和Suc 0.75 mg·kg-14 h后，取腎臟，室溫下放置一定時間，檢測Suc。結(jié)果如Fig 4所示，腎組織在室溫下放置12、24、36、48和72 h時，均可檢測到Suc(P<0.05或P<0.01)，但放置12 h時，Suc含量有明顯下降(P<0.01)，24 h時進(jìn)一步下降，大約減少了2/3，至72 h時雖仍可測出Suc(P<0.05)，但含量很低。該結(jié)果提示在室溫下放置，腎組織中Suc發(fā)生了明顯的降解。

Fig 2 Serum Suc concentration in rats subjected to A: Original maps of chromatogram of Suc.a：NS，b～d：Suc 0.75, 1.5 and 3.0 mg·kg-1; B: Serum Suc concentration.*P<0.05,**P<0.01 vs NS.

Fig 3 Drug contents in different organs from rats subjected to n=6)The content of Suc in heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, stomach, intestine and muscle from Suc-administered rats by UHPLC-MS/MS method.**P<0.01 vs Suc contents in other organs.

3 討論

本研究首次采用UHPLC-MS/MS方法，研究了中毒量Suc皮下給藥在大鼠體內(nèi)的分布情況，結(jié)果表明，UHPLC-MS/MS方法可測定中毒大鼠體內(nèi)Suc的藥量，Suc在大鼠血清及心、肝、腎等組織中均有分布，其中腎臟中含量最高。這可能與其水溶性較好，易于從腎臟排泄有關(guān)[13]；Suc在肝臟中含量比心臟、肺臟等臟器低，這可能是由于肝臟的血液循環(huán)較豐沛，Suc會被血液中的假性膽堿酯酶迅速水解，并且肝臟本身也存在假性膽堿酯酶水解Suc，只有10%～15%的藥量到達(dá)作用部位肌肉，所以肌肉組織中Suc含量也較少，而腦組織中Suc的含量較肝臟低，這可能與Suc存在血腦屏障有關(guān)[14]。這為Suc中毒的法醫(yī)鑒定取材部位提供了一定的參考。

Fig 4 Stability of Suc in renal tissues at The Suc content in kidney tissues of rats containing Suc after different time at room temperature.*P<0.05,**P<0.01 vs NS group,##P<0.01 vs Suc content at 4 h.

為模擬Suc飛鏢射殺致人死亡案件，本研究采用了皮下注射的方式。研究得出大鼠Suc的LD50為1.59 mg·kg-1，采用了低、中、高(0.75、1.5、3 mg·kg-1)3個濃度進(jìn)行實驗，Suc 3.0mg·kg-1組大鼠全部死亡，1.5 mg·kg-1組大鼠死亡一半，0.75 mg·kg-1組大鼠均無死亡。本研究不僅在1.5和3.0 mg·kg-1組的死亡和存活大鼠血清、心、脾、肝、肺、腎、腦、胃、腸及肌肉組織等主要臟器中均檢測到了Suc，在較低劑量的0.75 mg·kg-1組大鼠血清及除心、脾和腸以外的其它上述組織中也檢測到了Suc。結(jié)果表明UHPLC-MS/MS法不僅可檢測中毒死亡的大鼠體內(nèi)Suc，也可檢測中毒較輕的大鼠血清及腎等組織中的Suc，這為今后Suc中毒的司法檢驗提供了一個有效、可靠的方法。本研究觀察到腎組織樣品中Suc在室溫下穩(wěn)定性不是很好，放置12 h，Suc含量開始有明顯的下降，24 h時進(jìn)一步下降，大約減少了2/3，這可能與腎組織樣品中尚殘存能分解Suc的酶或物質(zhì)有關(guān)。因此，對疑似Suc中毒的法醫(yī)學(xué)取材后要盡可能地在12 h內(nèi)測定或低溫保存樣本。

此外，無論在大鼠血清中，還是在上述各主要臟器中，在0.75 ～ 3.0 mg·kg-1范圍內(nèi)，隨著給藥中毒劑量的增大，高劑量組大鼠體內(nèi)Suc含量呈數(shù)倍甚至數(shù)十倍的增加，這可能是由于高劑量的中毒給藥量明顯超過大鼠體內(nèi)代謝分解Suc的最大能力，導(dǎo)致未被代謝的Suc在體內(nèi)大量集聚所致。本研究重點觀察了中毒劑量的Suc在大鼠體內(nèi)的分布情況，至于其藥物代謝動力學(xué)其它有關(guān)參數(shù)有待今后的進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次采用UHPLC-MS/MS方法發(fā)現(xiàn)中毒量Suc皮下給藥在大鼠血清及心、肝、腎等主要組織中均有分布，其中腎臟中含量最高；同時也為Suc中毒者體內(nèi)藥量的檢測提供了一個有效、可靠的方法。

(致謝：本實驗在安徽醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心實驗室完成，對本實驗做出貢獻(xiàn)的所有人員表示衷心的感謝！)