淫羊藿苷促進MC3T3-E1成骨分化通過Hedgehog信號通路

辛紅美,許 潔，汪長東

(重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，重慶 400016)

骨骼疾病致短期或者長期身體疼痛及殘疾，治療該疾病花費接近全球國民生產總值3%[1]。成骨細胞整個分化過程包括間充質干細胞、前成骨細胞、成熟的成骨細胞、骨細胞。骨形成和骨吸收之間的平衡被打破，骨吸收的作用大于骨形成，會導致骨丟失和骨缺損疾病[2，3]。研究表明，MC3T3-E1成骨前體細胞具有活躍的生物性能，其增殖和分化對于骨丟失和骨缺損疾病的修復至關重要。

《中國藥典》記載，淫羊藿性辛、甘，有補腎陽，祛風濕，強筋骨的功效。臨床主要用于治療筋骨疲軟，腰背疼痛，風濕麻痹，麻木拘攣等，有最新研究報道[4]，其對小鼠AD模型具有改善作用。Xie等[5]研究表明，裝載有淫羊藿苷(icariin, ICA)的多孔復合支架可以通過成骨誘導和抑制破骨細胞活性促進骨的重建。Gong等[6]在研究人工骨膜促進骨再生的研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以促進MC3T3-E1細胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性明顯增強，以及骨鈣素(osteocalcin, OC)和Ⅰ型膠原蛋白酶(collagen Ⅰ, Col Ⅰ)表達增加。此外，在負載淫羊藿苷的纖維基質上培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞中鈣沉積明顯增多，證明淫羊藿苷可以促進成骨。丁懷利等[7]研究表明，RNAKL/OPG比例的變化在骨質疏松發(fā)病中起到重要作用，淫羊藿苷可以通過調節(jié)RANKL/OPG比例延緩了骨丟失隨年齡增長而加劇的趨勢，從而有效的防治骨質疏松癥。因此，我們想探究淫羊藿苷對MC3T3-E1成骨細胞的增殖和分化和作用機制，為中藥單體淫羊藿苷治療骨丟失疾病提供藥理基礎，以期更好的改善骨組織受損患者的生存質量。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體試劑：淫羊藿苷中藥對照樣品購自成都德思特生物技術有限公司，HPLC級(≥98%)；Alpha-MEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液購自HyClone公司；胎牛血清和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自重慶博培生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自Genview公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot凝膠試劑盒均購自碧云天公司?？贵w：β-actin抗體(Bioss,批號：bs-0061R);osteocalcin抗體(Bioss，批號：bs-4917R); ALP抗體(Bimake,批號：A5111)；Shh抗體(Bimake,批號：A5115)。

1.2 細胞培養(yǎng)和成骨誘導MC3T3-E1小鼠胚胎成骨細胞前體細胞在含有10%胎牛血清和抗生素(1×102U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)的α-MEM中生長，每3 d更換一次成骨培養(yǎng)基即10-8mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1抗壞血酸和10 mmol·L-1β-甘油磷酸鹽的培養(yǎng)基，在37 ℃含有5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中生長。

1.3 茜素紅染色α-MEM(10-8mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1抗壞血酸，10 mmol·L-1β-甘油磷酸)誘導成骨分化。細胞誘導14～21 d后，4%甲醛固定細胞。40 mmol·L-1茜素紅S(pH 4.4)室溫染色10 min。10 mmol·L-1磷酸鈉(pH 7.0)，10% cetylpyridinium chloride(sigma)處理細胞，562 nm測量吸光度值。

1.4 ALP活性檢測PBS洗滌MC3T3-E1細胞，超聲破碎。37 ℃孵育1 min，405 nm波長檢測吸光度值。堿性磷酸酶測定試劑盒購自中生北控生物科技有限公司，批號：160611。

1.5 CCK-8檢測MC3T3-E1細胞以5×104個/孔細胞接種到96孔板中，重復實驗3次。然后建立對照組和藥物組，細胞隨機分為6組：對照組，2.5、5、10、20和40 μmol·L-1，CCK-8測定。培養(yǎng)1、3和5 d后，加入10 μL CCK-8。37 ℃孵育3 h檢測490 nm吸光度。

1.6 Western blot檢測用裂解緩沖液(RIPA ∶PMSF=1 000 ∶1)裂解細胞，然后置冰上30 min。4 ℃， 12 000g離心10 min，取上清液進行蛋白質濃度測定。通過8%～10% SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白質，轉移至PVDF膜，用TBST(10 mmol·L-1Tris-HCL，150 mmol·L-1NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.6)溶解5%脫脂奶粉封閉1.5 h。分別用PBST稀釋ALP、OC和Shh一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜然后與HRP標記對應的二抗(1 ∶3 000)孵育。ECL化學發(fā)光系統(tǒng)顯色，使用ImageJ軟件分析結果。

2 結果

2.1 淫羊藿苷促進MC3T3-E1細胞增殖分別用2.5、5、10、20、40 μmol·L-1ICA處理MC3T3-E1細胞24、72、120 h，CCK-8檢測細胞增殖。結果顯示，2.5～40 μmol·L-1ICA處理組的吸光度值均較對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明ICA促進細胞增殖。

2.2 淫羊藿苷促進成骨分化各組MC3T3-E1細胞分別用不同濃度的ICA處理后，成骨誘導3 d檢測ALP活性。結果顯示，20 μmol·L-1ICA處理組和40 μmol·L-1ICA處理組的ALP活性明顯高于對照組(Fig 2A)。但是10 μmol·L-1ICA處理組的ALP活性相比對照組，差異并沒有統(tǒng)計學意義?？赡苁且驗榈蜐舛鹊腎CA處理并不能引起明顯的ALP活性改變，ICA促進成骨是劑量依賴性的，在一定范圍內高濃度ICA能引起成骨分化相關指標的顯著改變。所以我們后續(xù)實驗選擇40 μmol·L-1ICA作為最佳實驗濃度。AR-S結果表明，20 μmol·L-1ICA處理組和40 μmol·L-1ICA處理組比對照組的橘紅色沉積(鈣結節(jié))明顯增多(P<0.01)，說明ICA促進MC3T3-E1成骨細胞前體細胞鈣結節(jié)的形成從而促進成骨分化(Fig 2B)。與對照組相比，40 μmol·L-1ICA作為最佳實驗藥物濃度處理3 d后發(fā)現(xiàn)OC和ALP蛋白表達也明顯增高(P<0.05)，提示ICA對成骨分化的標志基因起促進作用(Fig 2C,2D)。這些結果表明，ICA可以加速MC3T3-E1細胞的成骨分化和礦化。同時，ALP和OC蛋白表達增加，表明ICA可以在早期和成熟階段促進成骨分化。

Fig 1 Effects of icariin on proliferation in MC3T3-E1 cells detected by CCK-8 *P<0.05,**P<0.01 vs control

2.3 淫羊藿苷促進成骨分化通過Hedgehog信號通路Hedgehog信號通路是參與成骨分化的關鍵通路。為了探究其是否參與調控淫羊藿苷促進成骨分化的進程，加入5 μmol·L-1Cyclopamine(CYC)，(Hedgehog通路的拮抗劑)。與40 μmol·L-1ICA處理組相比，ICA+CYC處理組ALP活性降低(P<0.01，F(xiàn)ig 3A)。在成骨誘導的d 21，進行AR-S檢測鈣沉積物。與40 μmol·L-1ICA組相比，ICA+CYC處理組細胞鈣沉積物數(shù)量減少(P<0.01，F(xiàn)ig 3B)。這些結果表明CYC抑制ICA增強成骨分化。40 μmol·L-1ICA組中shh蛋白表達量增加，ICA+CYC組明顯降低(P<0.01，F(xiàn)ig 3C,D)。這些結果說明ICA促進MC3T3-E1細胞的成骨分化，這一過程至少部分由Hedgehog信號通路調節(jié)。與40 μmol·L-1ICA處理組相比，加入CYC能夠明顯的降低鈣結節(jié)(Fig 3E)。

3 討論

淫羊藿苷分子量：676.65，化學式：C33H40O15，是從淫羊藿中提取的植物雌激素和類黃酮化合物，被亞洲國家廣泛用于治療骨質疏松癥。之前的研究表明它可以有效預防絕經后期婦女的骨質疏松癥[8-10]。MC3T3是C57BL/6乳鼠源性的成骨細胞，E1指的是它的亞屬，屬于前成骨細胞系，已成為整形外科和組織工程研究的熱點。此外一些研究發(fā)現(xiàn)，某些骨惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移也與成骨細胞密切相關[10]。成骨細胞增殖和分化對于骨重建過程中骨形成至關重要[11]。ALP是骨形成早期基因，在骨基質礦化中起重要作用[12]。OC是一種可以與鈣結合并促進礦物晶體形成從而開始礦化的糖蛋白，在骨形成過程中由成骨細胞分泌[13]。有研究表明10-7～10-5mol·L-1ICA干預在成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中可以增強成骨細胞的成骨分化作用[14]。本實驗采用ICA處理MC3T3-E1細胞，與對照組相比，20 μmol·L-1ICA處理組和40 μmol·L-1ICA處理組的ALP活性明顯增加，表明ICA可以在骨形成的早期階段促進成骨細胞的成熟。此研究結果表明，ICA可以明顯地促進成骨細胞前體細胞MC3T3-E1的增殖和成骨分化。

Fig 2 Icariin promotes osteoblast differentiation in MC3T3-E1 n=3)A:MC3T3-E1 cells were treated with Icariin(10, 20, or 40 μmol·L-1) or control, and further induced with osteogenic for 7 days, and then ALP activity in those cells was examined. B. MC3T3-E1 cells were treated with Icariin and further induced with osteogenic media for 21 days, and then those cells were subjected to Alizarin Red staining. Representative images were shown and quantitative mineralization levels were calculated. C. MC3T3-E1 cells were treated with 40 μmol·L-1 ICA or PBS as control, and further induced with osteogenic media for 3 days, and then cells were harvested for Western blot. D. Quantitation analysis of ALP and OC protein levels in Western blot(*P<0.05，**P<0.01 vs control group)

Hedgehog信號通路是參與動物胚胎發(fā)育最重要的信號通路之一，并且在出生后的組織修復、組織穩(wěn)態(tài)、細胞增殖等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動物中的3個hedgehog基因，包括Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh) 和Desert hedgehog(Dhh)。已經證明，Ihh和Shh均可以通過Runx2加速間充質祖細胞的成骨分化[16]。在我們的研究中，與40 μmol·L-1ICA處理組相比，ICA+CYC處理組中Hedgehog信號通路關鍵基因shh的蛋白表達量明顯下調且ALP活性和礦化能力下降。

Fig 3 CYC inhibits osteoblast differentiation resulting from treating ICA in MC3T3-E1 A:The MC3T3-E1 cells were treated with control, or 40 μmol·L-1 alone or the combination of 40 μmol·L-1 ICA and 5 μmol·L-1 Hedgehog pathway antagonist CYC and further induced with osteogenic media for 7 days, and then ALP activity in those cells was examined;B:The scanned images of Alizarin Red staining and quantitative mineralization levels;C:The MC3T3-E1 cells were treated with control, 40 μmol·L-1 Icariin alone or combination of 40 μmol·L-1 Icariin and 5 μmol·L-1 CYC and further induced with osteogenic media for 3 days, and then those cells were harvested for Western blot;D:Quantitative analysis of shh protein level from Western blot;E:The images of microscopic calcium nodules by Alizarin Red staining in the MC3T3-E1 cells(100×).(#P<0.05 vs 40 μmol·L-1 ICA group)

ICA主要通過調節(jié)一些Hedgehog信號通路靶基因的轉錄，從而促進成骨細胞分化。此外CYC可以顯著抑制ALP活性和shh蛋白表達量。在形態(tài)學上，我們也觀察到CYC明顯抑制礦化結節(jié)數(shù)量。結果表明Hedgehog信號通路介導ICA促進MC3T3-E1細胞成骨分化。

綜上，研究結果表明，ICA在成骨細胞的分化中起重要作用，主要通過Hedgehog信號通路發(fā)揮促進成骨分化的作用，對成骨細胞分化和增殖促進作用為骨質疏松癥的治療提供了新的思路和方向。我們還需要完善動物實驗來驗證這一作用，并最終將其應用于骨丟失和骨損傷疾病的臨床治療。