新化合物TDB通過PI3K/Akt通路抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡①

林春華 肖 敏 勞基通 楊照新 田樹紅 符 健

(海南醫(yī)學(xué)院，海南省藥物臨床前藥理毒理學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571199)

我國原發(fā)性肝癌約占全球的55%，病死率居惡性腫瘤第二位[1-3]。目前主要的治療手段包括手術(shù)、放療、化療等，但由于大多數(shù)肝癌早期的診出率低，往往錯過手術(shù)時機(jī)，而放化療毒副作用大，臨床應(yīng)用受到諸多限制，腫瘤患者仍然難以獲得令人滿意的生存收益[4-6]。因此，開發(fā)新的低毒、高效的抗腫瘤藥物對于肝癌治療手段的補(bǔ)充或替代都有著非常重要的意義。

苯并噁唑類化合物是一類有著廣泛生物活性的苯并雜環(huán)化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗炎、殺滅植物病毒功效和配位性能等[7-10]。TDB是一種以苯并噁唑?yàn)槟阁w優(yōu)化合成得到的新化合物，化學(xué)名稱為5-{[7-(金剛烷胺-1-基)-6-(2-甲氧乙氧基甲氧基)]-萘-2-基}-苯并[d]噁唑-2-胺，已取得國家專利證書，專利號CN201410355850.3[11]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TDB對結(jié)腸癌、胃癌、肝癌和腎癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用[11]。而增殖過度和凋亡受阻正是腫瘤發(fā)病的主要機(jī)制之一[12]。因此，本研究通過觀察TDB對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，以及對磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的作用，初步探討TDB抗肝癌的作用機(jī)制，為其開發(fā)成為抗肝癌新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 TDB(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)由海南道武生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司合成，純度>99%；人肝癌SMMC-7721細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hycolon公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC凋亡試劑盒和碘化丙啶(PI)購自美國BD公司；BCA蛋白定量試劑盒、Bax、Bcl-2抗體購自中國碧云天公司；Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)等抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；LY294002 PI3K抑制劑購自美國APExBIO公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖 取生長良好的對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h。分別采用濃度為5、10、12、15、18、20 μg/ml的TDB溶液分別作用于人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞，另設(shè)不加TDB處理的空白對照組。分別培養(yǎng) 24、48、72 h后將板取出，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄培養(yǎng)上清液，加入150 μl/孔的DMSO，低速振蕩10 min，然后酶標(biāo)儀測定492 nm波長下各孔的OD值。檢測各組細(xì)胞在不同時間、不同濃度下的增殖情況，并計(jì)算50%抑制濃度(IC50)。

圖1 新化合物TDB的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of new compound TDB

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察 將藥物處理48 h后的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察(×400)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡

1.2.4.1收集細(xì)胞 取生長良好的對數(shù)生長期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入5、10、15 μg/ml的TDB溶液處理，另設(shè)不加TDB處理的空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。用胰酶消化，并用PBS液洗滌2遍收集細(xì)胞。

1.2.4.2細(xì)胞周期的檢測 將收集好的細(xì)胞加入預(yù)冷的 70%乙醇固定過夜。次日，棄乙醇，PBS洗滌1次后加入PI染液，避光染色30 min，1 h內(nèi)上機(jī)測細(xì)胞周期。

1.2.4.3細(xì)胞凋亡的檢測 將收集好的細(xì)胞分別重懸于100 μl緩沖液，再加入AnnexinⅤ-FITC 5 μl和PI染料5 μl，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min后加入300 μl 緩沖液，1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5Western blot檢測Bax、Bcl-2、Cleaved Caspa-se-3、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)的蛋白表達(dá)情況 取生長良好的對數(shù)生長期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，分別加入不同濃度的TDB處理，另設(shè)不加TDB處理的空白對照組。48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后冰上裂解30 min，于4℃ 13 000 r/min離心10 min，取上清蛋白溶液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取制好的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。脫脂牛奶封閉后，加入一抗，于4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育 2 h。ECL顯影，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.6TDB聯(lián)合LY294002共處理對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 以PI3K 抑制劑 LY294002(20 μmol/L)單獨(dú)以及聯(lián)用TDB(15 μg/ml)分別作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞，與不加TDB處理的空白對照組比較，貼壁培養(yǎng)48 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1TDB對細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示(圖2)，不同濃度TDB作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h后，能明顯抑制細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)濃度和時間效應(yīng)。分別計(jì)算不同處理時間24、48、72 h的IC50值為13.35 μg/ml、10.69 μg/ml、4.84 μg/ml。取5、10、15 μg/ml TDB作用于SMMC-7721細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

2.2TDB對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 不同濃度TDB作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48 h后，在倒置相差顯微鏡下可見(圖3)：空白對照組SMMC-7721細(xì)胞呈單層、梭形貼壁生長，生長旺盛，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，形態(tài)規(guī)則，邊界清楚。TDB處理組，隨著濃度的增加，貼壁細(xì)胞減少，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞體積縮小，出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落漂浮于培養(yǎng)基現(xiàn)象。

2.3TDB對細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(圖4、表1)，TDB可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。5 μg/ml TDB處理組凋亡率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著TDB濃度的升高，細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴升高，其中10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組細(xì)胞總凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.01)。

2.4TDB對細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(圖5、表2)，與空白對照組比較，5 μg/ml TDB處理組細(xì)胞周期無明顯改變(P>0.05)，均大部分在G0/G1期。10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組明顯阻滯于S期(P<0.01)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.01)，呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖2 TDB對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of TDB on cell proliferation of SMMC-7721

圖3 TDB對SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.3 Effect of TDB on cell morphology of SMMC-7721

2.5TDB對Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示(圖6)，與空白對照組比較，10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組的Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平隨濃度的增大而上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值隨濃度的增大而下降(P<0.01)。5 μg/ml TDB處理組Cleaved Caspase-3蛋白及Bax蛋白表達(dá)水平均略高于空白對照組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平略低于空白對照組，以上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；該組Bcl-2/Bax比值小于空白對照組(P<0.05)，趨勢與10 μg/ml、15 μg/ml組一致。以上結(jié)果提示，10 μg/ml、15 μg/ml濃度下TDB能明顯促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡，與流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果基本一致。

圖4 TDB對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of TDB on cell apoptosis of SMMC-7721Note:Compared with control,**.P<0.01.

GroupsDose(μg/ml)Apoptosis rate(%)Control-10.99±0.84TDB1514.28±1.63TDB21033.50±3.651)TDB31556.23±3.601)

Note：Compared with control,1)P<0.01.

圖5 TDB對SMMC-7721細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of TDB on cell cycle of SMMC-7721Note:Compared with control,**.P<0.01.

2.6TDB對Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)

GroupsDose(μg/ml)G0/G1(%)S(%)G2/M(%)Control-70.89±1.7712.11±1.0116.96±1.49TDB1571.76±0.9912.92±0.4215.00±1.86TDB21064.23±1.671)22.64±2.461)13.17±0.90TDB31527.60±2.691)55.32±2.501)17.03±3.49

Note：Compared with control,1)P<0.01.

圖6 TDB對Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of TDB on expression of Bax，Bcl-2 and Cleaved Caspase-3Note:Compared with control,*.P<0.05，**.P<0.01.

圖7 TDB對Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of TDB on expression of Akt,p-Akt(Ser473),p-Akt(Thr308)Note: Compared with control，**.P<0.01.

蛋白表達(dá)的影響 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示(圖7)，10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)水平均低于空白對照組，隨濃度的增大而下調(diào)(P<0.01)，而Akt總蛋白相對表達(dá)量未見明顯變化(P>0.05)。同時，計(jì)算p-Akt/Akt，與空白對照組比較，10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組隨濃度的增大而比值下降(P<0.01)。而5 μg/ml TDB處理組Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)以及p-Akt/Akt比值與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示，TDB可能通過抑制SMMC-7721細(xì)胞PI3K/Akt信號通路的活化，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

2.7TDB聯(lián)合LY294002共處理對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(圖8，表3)，TDB組、LY294002組以及TDB聯(lián)合LY294002組的細(xì)胞凋亡率均高于空白對照組(P<0.01)，TDB聯(lián)合LY294002組細(xì)胞凋亡率高于TDB組、LY294002組(P<0.01)。結(jié)果表明，TDB可能通過抑制PI3K/Akt信號通路促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

圖8 TDB聯(lián)合LY294002共處理對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effect of TDB combined with LY294002 on cell apoptosis of SMMC-7721Note:Compared with control,**.P<0.01；compared with TDB+LY294002,##.P<0.01.

GroupsDoseApoptosis rate(%)Control-13.75±1.722)TDB15 μg/ml34.18±3.901)2)LY29400220 μmol/L57.23±4.111)2)TDB+LY29400215 μg/ml+20 μmol/L72.76±3.561)

Note：Compared with control,1)P<0.01；compared with TDB+LY294002,2)P<0.01.

3 討論

原發(fā)性肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著人類的健康。盡管目前有著多種治療手段，但效果并不理想。因此尋找新的抗腫瘤藥物或治療方案已成為研究者們的共同目標(biāo)。

本課題組前期研究結(jié)果表明，苯并噁唑類新型化合物TDB對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞和人肝癌Bel-7402細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性，但具體的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞過度增殖和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖和凋亡的失衡會造成細(xì)胞蓄積，分化不全，最終導(dǎo)致腫瘤的形成[13]。Bcl-2家族屬于凋亡相關(guān)蛋白，其家族成員Bcl-2、Bax通過調(diào)控線粒體膜的通透性來影響細(xì)胞色素C的釋放和下游 Caspase-3蛋白酶的活化，分別發(fā)揮著抗凋亡和促凋亡作用[14-17]。細(xì)胞接受凋亡信號后，促凋亡因子Bax和Bak會發(fā)生寡聚化，在線粒體表面構(gòu)成跨線粒體膜的孔，導(dǎo)致膜電位降低，線粒體的通透性增強(qiáng)，凋亡因子釋放進(jìn)而激活下游效應(yīng)型 Caspases，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而過度表達(dá)的抗凋亡分子Bcl-2能與Bax形成異源二聚體，阻止線粒體上孔的形成，對抗Bax的促凋亡作用[18]。其中，Caspase-3 作為Caspase 級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，其活化是細(xì)胞凋亡開始的標(biāo)志[19]。

本研究采用不同濃度的TDB處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞48 h，探討了TDB對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組可顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞阻滯于S期，并明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而5 μg/ml TDB處理組對細(xì)胞活性、周期和凋亡均未見明顯影響，考慮TDB濃度過低，未達(dá)到適宜的作用濃度。與此同時，凋亡相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果表明，10 μg/ml、15 μg/ml 處理組明顯上調(diào)Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平。提示TDB能通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax的表達(dá)水平，激活Caspase蛋白酶家族的酶解級聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)了Cleaved Caspase-3表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)了SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

近年來，隨著對腫瘤的深入研究，以腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的信號通路的關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略已成為抗腫瘤研究的一個重要方向[20]。PI3K/Akt信號通路在多種腫瘤的發(fā)生、存活、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與存活[21-23]。研究表明，在人類廣泛的腫瘤譜中均可觀察到PI3K/Akt 信號通路的異?；罨痆24]。蛋白激酶B(Akt)是PI3K/Akt信號通路中重要的信號分子，具有磷酸激酶活性。被PI3K激活后的Akt[例如：p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)]可誘發(fā)下游一系列底物，如凋亡相關(guān)蛋白Bad、Caspase-9、p53、NF-κB改變[25]。p-Akt能磷酸化Bad的Ser136位點(diǎn)，促使Bad與Bcl-2或Bcl-xl解離，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 水平，發(fā)揮抗凋亡作用；也可以磷酸化Caspase-9前體的Ser196位點(diǎn)，導(dǎo)致其活性被抑制，下調(diào)下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[26,27]。

因此，為進(jìn)一步探討TDB促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制，本研究檢測了PI3K/Akt信號通路的主要蛋白分子Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)的表達(dá)情況。結(jié)果提示，10 μg/ml、15 μg/ml TDB處理組的p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)蛋白水平明顯下調(diào)，而Akt總蛋白水平未見明顯變化；p-Akt/Akt的比值呈濃度依賴性下降。另外，采用PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合TDB共處理SMMC-7721細(xì)胞，細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果提示，TDB、LY294002均能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，在實(shí)驗(yàn)濃度下TDB促凋亡作用比LY294002強(qiáng)，且TDB聯(lián)合LY294002組促凋亡作用更優(yōu)于TDB處理組和LY294002處理組。提示TDB可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活性，促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明TDB 具有抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機(jī)制可能與TDB抑制PI3K/Akt信號通路的活化，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2水平、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，激活下游效應(yīng)型 Caspases促進(jìn)凋亡有關(guān)。對于TDB具體如何作用于PI3K/Akt信號通路，以及是否仍涉及其他信號通路的作用機(jī)制，尚需要進(jìn)一步深入研究。