白紋伊蚊唾液rAlb-34k2蛋白可黏附大腸桿菌并抑制其生長(zhǎng)①

田炎珅 徐 倩 金 芮 朱亞妮 商正玲 王政艷 程金芝 吳家紅

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550025)

蚊是一類重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)媒介，通過(guò)叮咬過(guò)程經(jīng)蚊唾液向人類傳播疾病。蚊唾液中不僅具有調(diào)控蚊蟲(chóng)吸食、吸血、傳播蚊媒病原等功能的蛋白分子[1-4]，同時(shí)也包括多種免疫活性分子，如C型凝集素、肽聚糖識(shí)別蛋白、溶菌酶等，參與維護(hù)蚊自身的免疫防御功能[5-8]。由于蚊唾液蛋白在蚊免疫防御與其向宿主傳病致病中的雙重作用，使得發(fā)現(xiàn)并闡明新的蚊唾液蛋白的免疫活性功能至關(guān)重要。據(jù)推測(cè)蚊唾液腺可分泌上百種生物活性蛋白，且大多數(shù)功能不清[5]。埃及伊蚊和白紋伊蚊是傳播登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒等蟲(chóng)媒病毒的主要蚊媒，在我國(guó)白紋伊蚊分布廣泛[9]。研究者在伊蚊屬雌蚊唾液腺轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)一組高表達(dá)、特異性的34k蛋白家族，并證實(shí)含有34k1和34k2兩個(gè)分泌性蛋白成員[10-12]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)未發(fā)現(xiàn)該家族蛋白存在可尋的生物學(xué)活性[13]。本課題組前期通過(guò)原核重組表達(dá)獲得了白紋伊蚊(廣州株)唾液34k2蛋白(rAlb-34k2)，在本文中利用細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)探討rAlb-34k2蛋白對(duì)大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的黏附效應(yīng)，同時(shí)以重組表達(dá)的同源蚊唾液的C型凝集素蛋白(命名為：rAalb-CTL2)為對(duì)照，分析對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)OD600值的影響，以期為發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊唾液腺高表達(dá)的34k2蛋白的免疫生物活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1重組蛋白 重組白紋伊蚊雌蚊唾液34k2蛋白[13](后文均簡(jiǎn)寫為rAlb-34k2)、重組白紋伊蚊雌蚊唾液CTL2蛋白(后文均簡(jiǎn)寫為rAalb-CTL2)，均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)、純化并獲得原核表達(dá)的可溶性蛋白。

1.1.2細(xì)菌 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)保存；鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌為貴州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院楊蕾老師提供。

1.1.3主要試劑和儀器 兔抗rAlb-34k2多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)于Invitrogen公司，彩虹180 kD廣譜蛋白Marker購(gòu)于北京Solarbio公司，ECL發(fā)光液購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。DYX-DH隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品，Epoch 2型超微量微孔板紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)BioTek公司，多功能成像分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，6YY-6型電泳儀購(gòu)于北京六一生物科技有限公司，3D漩渦混合儀購(gòu)于常州朗越儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的培養(yǎng) 將各細(xì)菌菌種接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日挑取單克隆菌至LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min氣浴恒溫振蕩器培養(yǎng)16 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Western blot檢測(cè)rAlb-34k2蛋白與細(xì)菌結(jié)合情況 5 000 r/min離心5 min，收集2 ml菌液中的菌體，用500 μl TBS緩沖液重懸菌體沉淀，加入500 μl rAlb-34k2蛋白溶液(終濃度為200 μg/ml)，陰性對(duì)照組加入500 μl TBS緩沖液，于室溫下3D旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育1 h，5 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀后用TBS緩沖液洗滌5次，用200 μl 7%SDS溶液孵育菌體10 min，離心收集最后的菌體沉淀和7%SDS上清液。將末次TBS洗脫液、7%SDS上清液及菌體沉淀作為樣品進(jìn)行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后利用兔抗rAlb-34k2蛋白多克隆抗體(5%脫脂奶粉稀釋1∶8 000)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(5%脫脂奶粉稀釋1∶10 000)進(jìn)行Western blot檢測(cè)[14]。

1.2.3分光光度計(jì)法檢測(cè)不同濃度的rAlb-34k2蛋白對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌(1 μl/孔)和10×LB液體培養(yǎng)基(10 μl/孔)加入96孔板，再按下述分組進(jìn)行加樣：①rAlb-34k2蛋白組：在細(xì)菌懸液中加入終濃度分別為137、112、96、64、48、32、16 ng/μl的rAlb-34k2蛋白溶液；②含Ca2+的rAlb-34k2蛋白組：在①組的基礎(chǔ)上各孔加入終濃度為30 mmol/L 的CaCl2溶液；③rAalb-CTL2蛋白對(duì)照組：在細(xì)菌懸液中加入終濃度與①組一致的rAalb-CTL2蛋白溶液；④含Ca2+的rAalb-CTL2蛋白對(duì)照組：在③組的基礎(chǔ)上各孔加入終濃度為30 mmol/L 的CaCl2溶液；⑤空白對(duì)照組。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，各孔總體積為100 μl。37℃培養(yǎng)，每隔4 h用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)振蕩后的各孔OD600值的變化。

2 結(jié)果

2.1rAlb-34k2蛋白可黏附多種細(xì)菌 rAlb-34k2蛋白與各細(xì)菌共孵育，利用Western blot檢測(cè)末次TBS洗脫液、7%SDS處理后上清液及細(xì)菌沉淀中rAlb-34k2蛋白，如圖1所示，各細(xì)菌組末次TBS洗脫液中未檢測(cè)到rAlb-34k2目的蛋白。在7%SDS處理的大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌的細(xì)菌上清液及菌體沉淀中均可檢測(cè)到目的蛋白，同時(shí)在7%SDS處理的銅綠假單胞菌上清液中也檢測(cè)到陽(yáng)性條帶，而處理的乙型溶血性鏈球菌上清液及菌體沉淀中均未檢測(cè)到rAlb-34k2蛋白；該結(jié)果提示rAlb-34k2蛋白可與大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌結(jié)合，而不能與乙型溶血性鏈球菌結(jié)合。

2.2不同濃度的rAlb-34k2蛋白可降低大腸桿菌的OD600值 基于rAlb-34k2蛋白可黏附大腸桿菌， 本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)法檢測(cè)不同濃度的rAlb-34k2蛋白對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的OD600值影響。由圖2A、B可知，137 ng/μl和112 ng/μl濃度的rAlb-34k2蛋白組的大腸桿菌OD600值曲線平緩，24 h內(nèi)OD600值分別波動(dòng)在0.063～0.294和0.097～0.349，且rAlb-34k2蛋白對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)影響與Ca2+的存在無(wú)關(guān)。選擇12 h和24 h時(shí)各組的OD600值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，各濃度的rAlb-34k2蛋白組的大腸桿菌OD600值均不同程度下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A～G)。此外，不同濃度的rAalb-CTL2蛋白(137 ng/μl、112 ng/μl和96 ng/μl)在Ca2+存在時(shí)具有促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)的效應(yīng)。

圖1 rAlb-34k2蛋白與不同細(xì)菌結(jié)合的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Western blot analysis of rAlb-34k2 protein binding to different bacteriaNote: M.Protein marker;1.Bacteria sediments;2.rAlb-34k2 protein;3.Last TBS eluent;4.7%SDS supernatants.

利用同樣的方法檢測(cè)rAlb-34k2蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌OD600值的影響，但均未發(fā)現(xiàn)明顯差異(數(shù)據(jù)未展示)。

3 討論

蚊唾液內(nèi)含有多種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，如C型凝集素、肽聚糖識(shí)別蛋白、革蘭陰性菌結(jié)合蛋白等，通過(guò)結(jié)合和識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)實(shí)現(xiàn)固有免疫反應(yīng)中的免疫識(shí)別效應(yīng)[15,16]，而PAMPs是廣泛分布于病原微生物表面某些共有的高度保守的分子結(jié)構(gòu)[17,18]。本研究不僅發(fā)現(xiàn)rAlb-34k2蛋白與大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的黏附效應(yīng)，同時(shí)在銅綠假單胞菌組中發(fā)現(xiàn)經(jīng)7%SDS變性劑處理的細(xì)菌上清中可檢測(cè)到目的蛋白，而細(xì)菌沉淀中目的蛋白消失，說(shuō)明rAlb-34k2蛋白與銅綠假單胞菌之間也存在較弱的黏附效應(yīng)。綜上，我們推測(cè)這些黏附效應(yīng)可能與rAlb-34k2蛋白具有識(shí)別這些細(xì)菌表面共同的保守結(jié)構(gòu)有關(guān)。由于rAlb-34k2蛋白與不同種類細(xì)菌的黏附存在差異，其所黏附的配體分子結(jié)構(gòu)尚不明晰，rAlb-34k2蛋白是否屬于一種蚊源的PRRs尚待更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

Ribeiro等[19]發(fā)現(xiàn)伊蚊屬雌蚊中含34k1和34k2兩個(gè)特異性分泌性蛋白[20]，Hastings等[21]利用酵母展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊唾液腺中34k蛋白家族成員十分豐富，Surasombatpattana等[22]發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊唾液34k1重組蛋白可增強(qiáng)DENV感染人角質(zhì)形成細(xì)胞，而目前關(guān)于伊蚊屬雌蚊唾液特異性34k2蛋白的生物學(xué)功能尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組前期通過(guò)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)飽血后白紋伊蚊唾液腺中34k2蛋白顯著下調(diào)[23]，本研究所錨定的rAlb-34k2蛋白是源自白紋伊蚊雌蚊唾液腺34k2基因的原核重組蛋白?；趓Alb-34k2蛋白可黏附多種細(xì)菌的結(jié)果，我們繼而探討了不同濃度的rAlb-34k2蛋白對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)OD600值變化的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12 h左右)不同濃度的rAlb-34k2蛋白抑制大腸桿菌OD600值升高均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以高濃度的rAlb-34k2蛋白(137 ng/μl、112 ng/μl)抑制大腸桿菌OD600上升的作用較為顯著。而該研究中rAlb-34k2蛋白并未影響金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的OD600值變化(數(shù)據(jù)未展示)。此外，我們還觀察到同源的rAalb-CTL2蛋白(一種來(lái)源于白紋伊蚊唾液腺的C型凝集素家族成員)處理大腸桿菌后，在Ca2+依賴下可促進(jìn)大腸桿菌OD600上升的相反結(jié)果，提示rAlb-34k2蛋白可能是一類與C型凝集素家族具有不同生物學(xué)效應(yīng)的蚊唾液蛋白分子。細(xì)菌生長(zhǎng)受多種因素影響，本研究中rAlb-34k2蛋白抑制大腸桿菌OD600增加的機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究證明。

白紋伊蚊在我國(guó)分布十分廣泛，其作為一種重要的傳病媒介在醫(yī)學(xué)上具有舉足輕重的地位。據(jù)估計(jì)伊蚊屬雌蚊唾液腺可分泌上百種差異蛋白組分，迄今對(duì)這些蚊唾液蛋白的生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)尚屬于起步階段。本研究發(fā)現(xiàn)rAlb-34k2蛋白可與多種不同細(xì)菌黏附，并對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定的抑制效應(yīng)，將為今后深入探討伊蚊屬唾液特異性34k2蛋白的生物功能及其與宿主免疫的相互關(guān)系提供前期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。