LGR5和E-cadherin在胃癌組織中的表達及臨床意義

譚 林 王 騫 陳維順 艾瓊嘉 劉敏姬 胡洪賽 屈偉明

作者單位：412007 株洲 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2013年數(shù)據(jù)顯示我國胃癌新發(fā)病例約43萬例，發(fā)病率排在全部惡性腫瘤的第3位［1］。目前，盡管胃癌的診斷和治療均取得了一定進展，但預(yù)后仍不理想，其中胃癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的重要原因。因此，亟需尋找特異性的預(yù)后預(yù)測及治療靶點。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，研究顯示上皮細胞表型蛋白E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達下調(diào)可導致EMT發(fā)生［2-4］。富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5）是一種表達于多種正常細胞及腫瘤細胞表面的膜蛋白，可通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導EMT，促進胃癌細胞侵襲遷移［5］。然而，LGR5和E-cadherin在胃癌中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系尚未清楚。本研究通過檢測LGR5和E-cadherin在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達，分析兩者與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為尋找胃癌新的生物學標志物提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年8月—2016年5月在中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院胃癌根治手術(shù)切除的癌組織標本115例及相應(yīng)的癌旁正常組織標本20例（均為手術(shù)切緣，病理證實無癌浸潤），其中男性82例，年齡35～86歲（平均年齡61.0歲）。納入標準：⑴經(jīng)病理診斷為胃癌；⑵術(shù)前未行化療及放療；⑶順利行胃癌根治術(shù)；⑷臨床及病理資料完整，可追蹤隨訪。排除標準：⑴合并其他惡性腫瘤者；⑵有嚴重心、肝、腎等重要臟器功能損害或其他嚴重基礎(chǔ)疾病者。組織標本獲取和使用經(jīng)本院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測胃癌組織LGR5和E-cadherin的表達

兔抗人LGR5多克隆抗體（ab75732）購自英國Abcam公司；鼠抗人E-cadherin單克隆抗（MAB-0738）購自福州邁新公司。所有標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水、透明、浸蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片，按照SP法進行免疫組化染色。高倍鏡視野（×200）下每片隨機選擇5個視野進行拍照觀察。結(jié)果判斷：由病理科醫(yī)師雙盲閱片，以細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核中出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒視為免疫組化染色陽性。免疫組化計分包括染色強度及陽性細胞比例確定。按染色強度分級：無染色或與背景一致的淺黃色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分。按陽性細胞比例分級：陽性細胞數(shù)＜5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，＞50%計3分。每張切片得分由染色強度評分與陽性細胞比例評分相加，0～3分為陰性表達，4～6分為陽性表達。

1.3 隨訪

采用門診或電話定期隨訪，自患者手術(shù)當天起每半年隨訪1次，隨訪截至2019年9月，以患者死亡、失訪或最后隨訪時間為終點，隨訪內(nèi)容主要為患者生存情況。中位隨訪時間為36個月，隨訪期間死亡60例?？偵嫫诙x為自患者入組開始至因任何原因死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。LGR5和E-cadherin在癌組織和癌旁正常組織中表達的差異及其與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗或校正χ2檢驗；LGR5與E-cadherin表達相關(guān)性采用Spearman檢驗；采用Kaplan-Meier法計算生存率、組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗；采用Cox比例風險回歸模型分析LGR5、E-cadherin與預(yù)后的關(guān)系。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中LGR5和E-cadherin的表達

LGR5主要表達于細胞質(zhì)，在胃癌組織中陽性率為62.6%（72/115），其中有轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽性率為78.9%（56/71），無轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽性率為36.4%（16/44）；在癌旁正常組織中的陽性率為35.0%（7/20）。胃癌組織與癌旁正常組織、有轉(zhuǎn)移胃癌組織與無轉(zhuǎn)移胃癌組織組的LGR5陽性表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=25.573，P＜0.001；χ2=20.969，P＜0.001）。

E-cadherin主要表達于細胞質(zhì)與細胞膜，在胃癌組織中陽性率為53.9%（62/115），其中有轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽性率為32.4%（23/71），無轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽性率為88.6%（39/44）；癌旁正常組織中的陽性率為100.0%（20/20）。胃癌組織與癌旁正常組織、有轉(zhuǎn)移胃癌組織與無轉(zhuǎn)移胃癌組織的E-cadherin陽性表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=44.829，P＜0.001；χ2=34.583，P＜0.001）。見圖 1。

圖1 LGR5和E-cadherin在胃癌及癌旁正常組織中的表達（SP×200）Fig.1 Expression of LGR5 and E-cadherin in gastric cancer tissues and adjacent normal tissues（SP×200）

2.2 LGR5和E-cadherin的表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

LGR5表達與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；E-cadherin的表達與腫瘤大小、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表1。

2.3 胃癌組織中LGR5表達與E-cadherin表達的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在胃癌組織中，LGR5與 E-cadherin的表達呈負相關(guān)（r=-0.318，P=0.001）。見表2。

2.4 LGR5和E-cadherin表達與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，LGR5陽性表達組1年、3年總生存率及中位生存時間分別為63.9%、38.9%、21個月，LGR5陰性表達組分別為88.4%、69.8%、36個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。E-cadherin陰性表達組1年、3年總生存率及中位生存時間分別為56.6%、30.2%、36個月，E-cadherin陽性表達組分別為87.1%、67.7%、15個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖2。

單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、LGR5表達陽性和E-cadherin表達陰性與預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、LGR5表達陽性及E-cadherin表達陰性是影響預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表1 LGR5和E-cadherin在胃癌組織中的表達及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression of LGR5，E-cadherin and the clinicopathological characteristics of gastric cancer tissues

表2 LGR5與E-cadherin在胃癌組織中表達的Spearman相關(guān)性分析Tab.2 Spearman correlation analysis of the expression of LGR5 and E-cadherin in gastric cancer tissues

圖2 LGR5和E-cadherin陽性表達與陰性表達胃癌患者的生存曲線Fig.2 Survival curves of gastric cancer patients with LGR5 and E-cadherin positive expression and negative expression

3 討論

LGR5是G蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質(zhì)亞家族中的一員，由富含18個亮氨酸的重復(fù)單位和7個跨膜區(qū)域組成。LGR5陽性表達的細胞具有某些干細胞特征，可表達于正常組織和腫瘤組織，在食管腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織中呈彌漫性過表達［6-7］。本研究發(fā)現(xiàn)，LGR5在胃癌中的表達高于癌旁正常組織，且主要在有轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達，提示LGR5在胃癌中可能發(fā)揮促癌作用，與國內(nèi)文獻報道基本一致［8-9］。進一步的臨床分析顯示LGR5在分化程度低、浸潤程度深、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移患者中高表達，提示LGR5高表達可能與腫瘤進展相關(guān)，表達量越高，腫瘤越易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示，LGR5表達陽性患者的生存率明顯低于LGR5表達陰性患者，多因素Cox回歸分析亦發(fā)現(xiàn)LGR5高表達是影響胃癌患者總生存期的獨立危險因素，說明LGR5高表達提示患者預(yù)后不良。WANG等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，過表達LGR5與結(jié)直腸癌不良預(yù)后相關(guān)。其可能機制為LGR5與配體R-脊椎蛋白（R-spodin）結(jié)合后，可以中和Rnf43/Znrf3的降解信號，從而活化 Wnt/βcatenin信號通路參與腫瘤的EMT過程，進而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，最終導致患者預(yù)后不良［11］。

表3 影響胃癌患者預(yù)后的Cox回歸分析Tab.3 Cox regression analysis of prognosis in gastric cancer patients

E-cadherin是一種依賴Ca2+的黏附分子，通過β-catenin等與肌動蛋白纖維相連形成并穩(wěn)定細胞間連接；E-cadherin的缺失是EMT的最重要的標志性變化，也是上皮腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的前提條件［12］。研究證明EMT在包括胃癌在內(nèi)的多種上皮源性腫瘤侵襲和早期轉(zhuǎn)移中起決定性作用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在胃癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，且在轉(zhuǎn)移組織中的表達低于無轉(zhuǎn)移的胃癌組織，同時E-cadherin在浸潤程度深、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移患者中低表達，且E-cadherin陰性表達患者術(shù)后總生存期低于陽性表達患者，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin是影響患者總生存的獨立因素，說明E-cadherin與胃癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且E-cadherin低表達提示患者預(yù)后不良，與現(xiàn)有文獻［15-16］報道基本一致。

本研究進一步分析LGR5與E-cadherin表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈負相關(guān)。既往有研究發(fā)現(xiàn)，LGR5在胃癌組織中表達明顯上調(diào)，且與EMT誘導因子PRRX1、TWIST1和BMI1的表達密切相關(guān)，在胃癌細胞中LGR5可通過激活TWIST1下調(diào)E-cadherin表達，從而誘導EMT的發(fā)生，促進細胞侵襲轉(zhuǎn)移［17］。故推測LGR5可能通過影響E-cadherin的表達促進EMT發(fā)生，最終導致胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后。

綜上所述，LGR5在胃癌中高表達，且與患者不良預(yù)后有關(guān)，可能通過下調(diào)E-cadherin的表達而促進EMT發(fā)生實現(xiàn)。LGR5有望作為評估患者預(yù)后、監(jiān)測術(shù)后腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子標志物及診療的新靶點。但本研究為單中心回顧性研究，且納入臨床樣本量有限，有關(guān)結(jié)論尚需多中心大樣本研究加以證實。