多西他賽聯(lián)合基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT對前列腺癌移植瘤生長的影響

潛 力 符翠莉 李錫明 黃桂海 林俊浩 李 偉

作者單位：530021 南寧 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院1藥學部；2泌尿外科

我國前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病率由1988年的1.96/10萬升至2015年的60.3/1 000［1-3］。傳統(tǒng)內分泌治療可暫時緩解中晚期患者癥狀，但幾乎所有患者均不可避免要經歷去勢抵抗性前列腺癌階段，以阿比特龍和恩扎盧胺為代表的新型內分泌藥物雖然可在一定程度上延緩去勢抵抗性前列腺癌進展，但總體療效仍不理想［4-6］?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是由結締組織細胞分泌，依賴鋅離子的內肽酶基因家族，可通過降解細胞外基質和基底膜促進腫瘤的侵襲和轉移［7-8］，其重要成員MMP-2和MMP-9在前列腺癌骨轉移中發(fā)揮了重要作用［9］。SB-3CT是MMP-2和MMP-9強有力的抑制劑，目前研究顯示SB-3CT可通過降低瘤體內血管密度和骨質降解從而抑制前列腺癌骨轉移瘤［10］。以多西他賽為基礎的化療是治療去勢抵抗性前列腺癌的首選方案，但多西他賽單藥并不能有效控制疾病進展［11］。本團隊前期研究顯示，基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT聯(lián)合多西他賽對體外培養(yǎng)的前列腺癌PC-3細胞生長具有顯著的抑制作用［12］，為進一步證實基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT聯(lián)合多西他賽的聯(lián)合用藥療效，本研究在此基礎上建立了人PC-3前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，觀察其對裸鼠移植瘤生長的影響，并初步探索潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人前列腺癌細胞PC-3購于上海中國科學院細胞庫，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，細胞80%融合度達80%時傳代，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SPF級Balb/c Nude小鼠15只購于重慶騰鑫生物技術有限公司，4～6周齡，20～25 g，雄性。飼養(yǎng)于SPF室超凈層流架內，動物房12 h-12 h晝夜交替，自由飲水、進食，溫度23～25℃，適應性喂養(yǎng)1周后進入實驗。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；SB-3CT、多西他賽購自美國Sigma公司；兔抗人PDK1單克隆抗體、兔抗人PFKFB4單克隆抗體和HRP的二抗均購自美國Abcam公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。動物實驗符合倫理要求。

1.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組

取對數(shù)生長期的PC-3細胞制成濃度為6×107/mL的細胞懸液，并于裸鼠右腋部位皮下接種150 μL。皮下接種1周后觀察成瘤情況及裸鼠生長狀況，待長出腫瘤后，每隔2 d用游標卡尺測量腫瘤長徑、短徑并計算腫瘤體積（腫瘤體積=長徑×短徑2/2），繪制腫瘤生長曲線。待移植瘤體積達100mm3時按不同分組進行處理，實驗分為3組：SB-3CT組裸鼠5只，瘤體注射SB-3CT溶液25 mg/kg，每周3次，連續(xù)4周；聯(lián)合用藥組裸鼠5只，在瘤體注射SB-3CT的基礎上靜脈注射多西他賽溶液10 mg/kg，每周1次，連續(xù)4周；空白對照組裸鼠5只，瘤體注射等量生理鹽水。給藥5周結束后，裸鼠用3.5%水合氯醛（10 mL/g）麻醉，脫頸處死，剝離腫瘤組織，稱重，PBS緩沖液洗凈，4%多聚甲醛固定。

1.3 免疫組化檢測裸鼠移植瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達

組織經脫水包埋，4 μm連續(xù)切片后，按照SP法進行免疫組化染色。采用免疫組化評分評估PDK1和PFKFB4的表達量。評分標準如下：陽性細胞比例0、1%～10%、11%～50%、51%～80%、81%～100%分別計為0分、1分、2分、3分、4分；再按染色強度無、弱、中、強分別計為0分、1分、2分、3分，最終評分為兩個指標的乘積［13］。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差異法（LSD法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠一般狀況

3組實驗動物皮下注射細胞懸液2周左右于皮下均可觸及瘤體結節(jié)，成瘤率為100%。實驗期間瘤塊持續(xù)生長，多為圓形或橢圓形，大小較均勻。連續(xù)給藥4周，各組裸鼠藥物耐受性良好，未出現(xiàn)死亡情況。相對于空白對照組和SB-3CT組，聯(lián)合用藥組瘤塊體積生長較緩慢。

2.2 SB-3CT對裸鼠移植瘤生長的影響

空白對照組平均瘤體質量為（1.34±0.05）g，SB-3CT組平均瘤體質量為（1.08±0.13）g，聯(lián)合用藥組平均瘤體質量為（0.88±0.08）g，3組平均瘤體質量差異有統(tǒng)計學意義（F=29.556，P=0.001），且聯(lián)合用藥組低于SB-3CT組（P=0.006）。與空白對照組和SB-3CT組相比，聯(lián)合用藥組腫瘤生長速度明顯緩慢，見圖1。

圖1 裸鼠移植瘤的生長曲線Fig.1 Growth curves of nude mice xenograft

2.3 裸鼠移植瘤腫瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達

顯微鏡下觀察各組裸鼠離體腫瘤組織，可見細胞異型性明顯，排列紊亂，核仁濃染，分裂相增多，符合惡性腫瘤組織特征。

PDK1在空白對照組腫瘤組織內染色呈片狀，中等強度著色，陽性物質呈棕褐色或棕黃色，位于胞漿，組織間結締組織可見強弱不等的非特異性染色；SB-3CT組和聯(lián)合用藥組染色陽性區(qū)域范圍較空白對照組減少，染色強度偏弱，見圖2。免疫組化結果顯示，聯(lián)合用藥組、空白對照組和SB-3CT組的染色評分分別為（2.33±0.47）分、（6.00±0.81）分和（4.33±0.48）分，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=18.200，P=0.003），且聯(lián)合用藥組評分低于SB-3CT組（P=0.017）。

PFKFB4在空白對照組和聯(lián)合用藥組均明顯表達，陽性物質主要定位于細胞質，空白對照組大部分區(qū)域呈強陽性表達，聯(lián)合用藥組表達總體呈中等強度染色，染色陽性比例低于空白對照組，見圖2。免疫組化結果顯示，聯(lián)合用藥組、空白對照組和SB-3CT組的染色評分分別為（5.33±0.49）分、（11.33±0.47）分和（9.00±1.41）分，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=17.643，P=0.003），且聯(lián)合用藥組評分低于SB-3CT組（P=0.011）。

圖2 免疫組化檢測PDK1和PFKFB4在裸鼠移植瘤組織中的表達（SP染色）Fig.2 Expression of PDK1 and PFKFB4 in nude mice xenografts detected by immunohistochemical staining（SP staining）

3 討論

既往研究證實基質金屬蛋白酶抑制劑可有效抑制MMP-9高表達的T細胞淋巴瘤肝轉移［14］。SB-3CT在體內具有抑制明膠酶活性作用，通過降低腫瘤血管化和血管生成可抑制前列腺癌骨轉移瘤［10］。前列腺癌組織普遍存在MMP-9高表達，且其表達程度與臨床病理分期呈正相關，與腫瘤分化程度呈負相關［15-16］，提示MMP-9高表達可能在前列腺癌侵襲和進展中起關鍵作用，而以MMP-9為靶點的藥物已用于臨床治療前列腺癌［17］。多西他賽化療雖然是目前治療去勢抵抗性前列腺癌的一線方案，但單藥治療效果欠佳。一項來自歐洲的單中心研究顯示［11］，多西他賽治療去勢抵抗性前列腺癌患者，經過平均1.6年的隨訪，94.1%的患者出現(xiàn)疾病進展并導致68.6%的患者死亡。本團隊前期的體外細胞學實驗結果證實：基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT可抑制前列腺癌PC-3細胞的存活，且10.0 μmol/L的SB-3CT濃度即可達到明顯的抑制作用，28.8 μmol/L為半數(shù)抑制濃度，藥物協(xié)同指數(shù)顯示多西他賽與SB-3CT在體外具有較強的協(xié)同作用，與多西他賽單藥相比，聯(lián)合用藥對體外培養(yǎng)的PC-3細胞存活具有更顯著的抑制作用［12］。本研究構建前列腺癌裸鼠移植瘤模型，進一步證實聯(lián)合應用多西他賽和SB-3CT可降低裸鼠移植瘤的質量，生長曲線顯示SB-3CT單藥和多西他賽聯(lián)合用藥均可降低裸鼠移植瘤生長速度，且與SB-3CT單藥相比，聯(lián)合用藥具有更強的抑制作用，與前期體外細胞學實驗結論一致。

腫瘤細胞具有獨特的糖代謝特點，大多數(shù)惡性腫瘤細胞存在高代謝特征，特別是惡性腫瘤細胞的分裂增殖較正常細胞快，能量消耗相應增加，因此癌細胞的異常過度增殖常伴隨葡萄糖過度消耗。近年來，隨著氟代脫氧葡萄糖－正電子發(fā)射計算機斷層顯像（FDG-PET）的廣泛臨床應用，腫瘤細胞的糖代謝變化成為研究熱點?！澳芰看x異常”已被公認為腫瘤細胞的一個標志性特征［18-19］。PDK1和PFKFB4是細胞糖代謝途徑中的關鍵酶，本團隊前期采用shRNA沉默前列腺癌PC-3細胞中PDK1和PFKFB4基因的表達，發(fā)現(xiàn)PDK1和PFKFB4基因表達降低具有抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用；基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT可顯著降低體外培養(yǎng)的PC-3細胞的葡萄糖消耗量，抑制細胞內PDK1和PFKFB4基因表達和提高細胞內活性氧（ROS）水平，這可能是SB-3CT發(fā)揮其作用的潛在分子機制［20］。本研究是前期細胞學實驗基礎上的進一步延續(xù)，剝離裸鼠移植瘤后，采用免疫組化檢測各組裸鼠離體腫瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達情況，結果顯示聯(lián)合用藥亦可降低腫瘤組織內PDK1和PFKFB4的表達，與前期的體外細胞學實驗結果一致，進一步驗證了基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT聯(lián)合多西他賽較SB-3CT單藥可在體內進一步降低PDK1和PFKFB4的表達，繼而可能通過降低腫瘤組織的糖代謝活性，從而發(fā)揮抑制前列腺癌移植瘤生長的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽聯(lián)合基質金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT對前列腺癌裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且可能通過降低腫瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達而影響糖代謝活性實現(xiàn)，多西他賽聯(lián)合SB-3CT有望成為去勢抵抗性前列腺癌治療的新方案。