基于單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析膀胱腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成

賴智勇 胡嘉欣 李枝鍵李天宇 謝遠(yuǎn)亮 王秋雁

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究中心；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科；3廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，2018年全球約有54.9萬(wàn)例新發(fā)病例和20萬(wàn)例死亡病例［1］。膀胱癌具有多中心、易復(fù)發(fā)及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)等特點(diǎn)［2］，目前越來(lái)越多的證據(jù)表明膀胱癌是一組分子異質(zhì)性疾?。?-4］。腫瘤異質(zhì)性是影響治療效果的主要因素之一［5］。因此，對(duì)膀胱癌異質(zhì)性進(jìn)行研究，分析不同患者疾病特點(diǎn)，有助于提供個(gè)性化治療。單細(xì)胞技術(shù)可通過(guò)分析腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞亞群的多樣性及進(jìn)化關(guān)系實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤異質(zhì)性研究［6］。作為單細(xì)胞理論的一種代表性應(yīng)用，單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)（single-cell mass cytometry，CyTOF）采用金屬同位素標(biāo)記抗體，克服了傳統(tǒng)流式通道間發(fā)射光譜信號(hào)重疊帶來(lái)的影響，且可同時(shí)對(duì)單個(gè)細(xì)胞中多達(dá)40種參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞亞群的精確分析［7］。自從實(shí)現(xiàn)對(duì)人外周血細(xì)胞組分檢測(cè)以來(lái)［8］，CyTOF 在腎癌［9］、肺腺癌［10］、乳腺癌［11］等多種實(shí)體腫瘤的異質(zhì)性分析中發(fā)揮了重要作用。本研究采用CyTOF對(duì)膀胱癌及癌旁組織的浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞進(jìn)行分群，并比較免疫細(xì)胞組成的差異，以期為膀胱癌的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年12月—2019年3月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行膀胱癌根治術(shù)的患者為研究對(duì)象，收集其癌組織及其癌旁組織（距離腫瘤邊緣2 cm）。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)后病理確診為膀胱癌；⑵術(shù)前未接受免疫治療、靶向治療及放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)者；⑵根治術(shù)后膀胱解剖提示組織壞死嚴(yán)重者；⑶膀胱腫瘤多發(fā)，未取得癌旁組織者。共4例患者符合標(biāo)準(zhǔn)納入研究，臨床病理資料見(jiàn)表1。本研究通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS特級(jí)血清購(gòu)自北京Cellmax公司；膠原酶I購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；臺(tái)盼藍(lán)染液、紅細(xì)胞裂解液及HBSS平衡液及青/鏈霉素雙抗混合液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Dnasel、DMSO均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Fc受體封閉溶液購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；抗體穩(wěn)定緩沖液購(gòu)自德國(guó)Candor Bioscience公司；MaxPar抗體標(biāo)記試劑盒、順鉑、鑭系金屬標(biāo)簽、EQTM四元素校準(zhǔn)磁珠、Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)Fluidigm公司；MACSmixTM組織混懸儀、GentleMACS組織解離器均購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司。

表1 膀胱癌患者的臨床病理資料Tab.1 Clinicopathological characteristics in patients with bladder cancer

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單細(xì)胞懸液的制備 取新鮮膀胱癌組織及其癌旁組織，剪碎后轉(zhuǎn)移至C管，加入膠原酶Ⅰ溶液（每l mL HBSS 加入 2 mg膠原酶Ⅰ和 20 μg DNaseI），置于gentleMACS組織處理器上解離。然后置于混懸儀上，37℃孵育，至無(wú)明顯塊狀。于70 μm細(xì)胞濾器冰上過(guò)濾組織懸液，4℃離心后棄上清液。冰上裂解紅細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS重懸洗滌。按體積比1∶9將DMSO、FBS配制成凍存液，-80℃保存。

1.3.2 鑭系金屬探針標(biāo)記 向管內(nèi)加入95 μL L-Buffer重懸polymer，加入鑭系金屬溶液混勻，37℃水浴。50 kDa 超濾管中加入 100 μg 抗體和 400 μL R-Buffer，12 000×g，離心棄濾液。稀釋TCEP至4 mmol/L。超濾管中加入TCEP-R-Buffer，混勻后37℃水浴30 min。取3 kDa超濾管，加入200 μL L-Buffer以及metal-loaded polymer混合物，離心，棄濾液。柱中加入400μL C-Buffer，離心，棄濾液。取出50kDa超濾管，加入300μLC-Buffer，離心，棄濾液。取出3 kDa超濾管和50 kDa超濾管后棄濾液，3 kDa超濾管中加入C-Buffer，重懸metalloaded polymer，轉(zhuǎn)移至50 kDa超濾管中吹打混勻，37℃孵育90 min。取出濾管，抗體混合液中加入W-Buffer，離心后清洗 3次，管內(nèi)加入80 μL W-Buffer，混勻，檢測(cè)抗體濃度，離心后加入抗體穩(wěn)定液，再次離心，-20℃保存。

1.3.3 細(xì)胞表面抗體標(biāo)記 37℃下快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞，離心去除DMSO后加入完全培養(yǎng)基重懸。稀釋?xiě)乙汉笕∩倭坑糜谂_(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)后留取150萬(wàn)細(xì)胞，PBS重懸。按1∶10 000比例配制Cisplatin，每管加入1 mL，避光孵育5 min，4℃離心，加入細(xì)胞染色緩沖液（CSB）后離心。按1∶50配制Fc受體阻斷劑，每管加入50 μL，孵育10 min。每管加入50 μL抗體混合物，孵育1 h后加入CSB清洗，離心后棄上清液。按1∶4配制核抗原染色緩沖液工作溶液，每管加入1 mL，孵育30 min后加入2 mL核抗原染色滲透液，離心棄上清液。每管加入1 mL 1.6%甲醛工作液固定，孵育10 min，離心棄上清液。每管加入Ir工作液（1∶1 000），混勻后4℃過(guò)夜。取出樣本，加入CSB及ddH20清洗。每管加入10%EQTM四元素校準(zhǔn)磁珠溶液，重懸細(xì)胞，4℃保存，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 CyTOF質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 采用Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品中腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞26種免疫相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。采集流式數(shù)據(jù)后，導(dǎo)入CyTOF軟件（v6.7）進(jìn)行歸一化合并。于Cytobank云平臺(tái)（https：//www.cytobank.org/）分析流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)文件（FCS）數(shù)據(jù)。通過(guò)t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）算法生成t-SNE圖，對(duì)CD45+細(xì)胞進(jìn)行聚類，分析不同細(xì)胞亞群表型及相對(duì)含量的差異。實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析流程Fig.1 Experimental design and data analysis flow

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。鑒于本研究中的樣本量過(guò)少（n=4），故根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點(diǎn)，選擇配對(duì)樣本t檢驗(yàn)的Bootstrap法比較膀胱癌組織和癌旁組織兩組數(shù)據(jù)中各類細(xì)胞亞群之間的差異。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞亞群分布

根據(jù)門(mén)控圈取的20 000個(gè)CD45+免疫細(xì)胞上主要免疫標(biāo)志物的表達(dá)水平，將其分成7個(gè)CD4+T細(xì)胞簇（CD3e+、CD4+、CD45RO+），即亞群 01、03、05、07、10、11、22；8 個(gè) CD8+T 細(xì)胞簇（CD3e+、CD8a+），即亞 群 02、04、08、13、16、17、21、25；4 個(gè) 巨 噬 細(xì) 胞 簇（CD3e-、CD11c+、CD14+、CD38+、CD45RO+、HLA-DR+），即亞群 06、12、18、23；2 個(gè) B 細(xì)胞簇（CD3e-、CD19+、CD20+、CD45RA+、HLA-DR+），即亞群 09、14；1 個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞簇 （CD3e-、CD38+、CD45RO+、HLA-DR+），即亞群24和3個(gè)其他類型免疫細(xì)胞（15、19、20），見(jiàn)圖2A～B。聚類分析結(jié)果顯示這些細(xì)胞亞群具有多樣性，見(jiàn)圖2C。

圖2 膀胱腫瘤微環(huán)境免疫概況Fig.2 Overview of bladder cancer microenvironmental immunity

2.2 膀胱癌組織與癌旁組織中免疫細(xì)胞亞群的差異性

基于細(xì)胞表型間的相似性，本研究將癌組織與癌旁組織中CD45+細(xì)胞分為13類主要免疫細(xì)胞，分別為B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（macrophages）、樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells）、自然殺傷細(xì)胞（NK cells）、CD8+幼稚T細(xì)胞（CD8+T naive）、CD8+中樞記憶 T細(xì)胞（CD8+TCM）、CD8+有效記憶 T 細(xì)胞（CD8+TEM）、CD8+終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD8+TEMRA）、CD4+Treg細(xì)胞、CD4+幼稚 T 細(xì)胞（CD4+T naive）、CD4+TCM、CD4+TEM、CD4+TEMRA，其在癌組織及癌旁組織中的分布特點(diǎn)見(jiàn)圖3A。根據(jù)這些細(xì)胞表達(dá)抗體標(biāo)記的差異性，進(jìn)一步將其手工標(biāo)記細(xì)分為18個(gè)免疫細(xì)胞亞群，包括CD4+T（CD4+Treg細(xì)胞、CD4+T naive、CD4+TCM、CD4+TEM、CD4+TEMRA），CD8+T（CD8+T naive、CD8+TCM、CD8+TEM、CD8+TEMRA），DP，DN 等 11 個(gè) T 細(xì)胞亞群以及B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，CD14-HLA-DR+，CD14-HLA-DR-，CD19-CD3-。通過(guò)Sunburst圖呈現(xiàn)這18個(gè)免疫細(xì)胞亞群在CD45+細(xì)胞中的占比（圖3B），發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的占比最大，在癌組織和癌旁組織中的平均占比分別為76.73%、47.60%；其次為B細(xì)胞，在癌組織和癌旁組織中平均占比分別為6.34%、15.20%；巨噬細(xì)胞在癌組織和癌旁組織中占比分別為8.84%、23.82%。將4例患者數(shù)據(jù)合并后計(jì)算發(fā)現(xiàn)，CD4+Treg細(xì)胞在癌旁組織中平均占比為0.81%，在癌組織中為2.20%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016），而其他類型免疫細(xì)胞的所占比例組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖 3B～C。

圖3 膀胱癌組織與癌旁組織免疫細(xì)胞亞群之間的差異Fig.3 Difference in immune cell subpopulations between bladder cancer tissues and paracancerous tissues

3 討論

免疫治療在腫瘤治療中取得了較大進(jìn)展，目前主要的免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1/PD-L1為多種實(shí)體腫瘤患者帶來(lái)了長(zhǎng)期的生存獲益［12-14］，但是客觀有效率僅為10%～30%［12］。膀胱癌診斷主要依靠組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，但因存在組織學(xué)變異，不同患者預(yù)后并不同［15］。GALON 等［16］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和總生存時(shí)間在很大程度上取決于局部適應(yīng)性免疫反應(yīng)的狀態(tài)，腫瘤樣本中免疫細(xì)胞的類型、密度和位置較組織病理學(xué)檢查能更好地預(yù)測(cè)患者生存。單細(xì)胞技術(shù)是目前用于研究腫瘤異質(zhì)性的重要手段［17］，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)作為其代表應(yīng)用之一，結(jié)合了傳統(tǒng)流式分析方法和質(zhì)譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn)［7］。從方法學(xué)上，質(zhì)譜流式技術(shù)能夠區(qū)分不同的細(xì)胞亞群，有助于對(duì)腫瘤異質(zhì)性分析。

本研究基于CyTOF比較了4例膀胱癌患者癌組織與癌旁組織中的免疫細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，采用免疫細(xì)胞標(biāo)志物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，可將其分為25個(gè)亞群，主要包括8類細(xì)胞群：CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和其他類型的免疫細(xì)胞。同時(shí)也得到了每個(gè)細(xì)胞亞群在CD45+細(xì)胞中的占比。其中T細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞群，在癌組織中占比較大，其次為B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，與CHEVRIER等［9］對(duì)腎透明細(xì)胞癌的研究結(jié)果相符。T細(xì)胞及B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞在癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)，提示不同免疫細(xì)胞的富集具有一定的組織傾向性。同時(shí)這些細(xì)胞亞群在不同患者中的占比相差較大，也反映了不同個(gè)體間腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。

CD4+Treg細(xì)胞是一類胸腺來(lái)源的細(xì)胞，具有維持自身耐受，調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)作用［18］。其介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤免疫逃逸機(jī)制之一，也是目前進(jìn)行腫瘤免疫治療的主要障礙［19-20］。發(fā)生免疫逃逸的腫瘤可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)性白細(xì)胞的募集、擴(kuò)增和功能，避免被免疫系統(tǒng)檢測(cè)和消除［21］。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+Treg細(xì)胞比例在膀胱癌組織和癌旁組織中存在差異（2.20%vs 0.81%），盡管其占比較小。在許多人類癌癥中，Tregs細(xì)胞的高度浸潤(rùn)與患者預(yù)后不良有關(guān)［22］。研究證實(shí)CD4+Treg細(xì)胞與膀胱癌患者的病理分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)均呈正相關(guān)［23-25］。因此，本研究認(rèn)為CD4+Treg細(xì)胞在膀胱癌組織中的相對(duì)富集，可能介導(dǎo)了膀胱腫瘤對(duì)機(jī)體的免疫逃逸，因此值得對(duì)CD4+Treg細(xì)胞群開(kāi)展更深入的研究，探究其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。

本研究存在以下不足：⑴樣本量較少。因早期診斷的表淺膀胱腫瘤多采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療，組織標(biāo)本體積較小，且經(jīng)過(guò)燒灼后細(xì)胞活力較低，故該類患者未納入本研究。⑵可用商品化抗體較少。當(dāng)前質(zhì)譜技術(shù)仍在發(fā)展中，可用的高質(zhì)量免疫細(xì)胞抗體數(shù)量相對(duì)較少，有待更多高質(zhì)量商品化抗體的推出，以覆蓋對(duì)更多免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)。

本研究通過(guò)CyTOF實(shí)現(xiàn)了對(duì)膀胱浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的初步分群，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞為膀胱腫瘤微環(huán)境中的主要細(xì)胞群，且在癌組織中相對(duì)比例更高，而B(niǎo)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞則在癌旁組織中相對(duì)更高。CD4+Treg細(xì)胞在膀胱癌組織中的相對(duì)富集，可能介導(dǎo)了膀胱腫瘤對(duì)機(jī)體的免疫逃逸。此外，本研究提供了一種通過(guò)降維算法t-SNE分析膀胱癌和癌旁浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞差異性的方法。希望后續(xù)能夠通過(guò)更大且獨(dú)立的隊(duì)列，分析更多的細(xì)胞亞群，為闡明膀胱癌的發(fā)病轉(zhuǎn)移機(jī)制提供參考依據(jù)。