微小RNA-130b在嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細胞損傷中的作用及機制

王萬鵬 蒯巧林 唐伯玉 王維 梁森林 潘艷 高甄典 李娟

223400 淮安，南京醫(yī)科大學康達學院附屬漣水縣人民醫(yī)院腎臟科(王萬鵬，蒯巧林，唐伯玉，梁森林，高甄典，李娟)，檢驗科(王維，潘艷)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一個世界性的公共衛(wèi)生與健康問題[1]。越來越多的基礎(chǔ)及臨床研究表明，無論原發(fā)病如何，蛋白尿均可加速CKD的進展。因此蛋白尿是CKD防治工作中重要的靶點，減少蛋白尿的發(fā)生發(fā)展將有助于延緩CKD的進展，改善患者預(yù)后。足細胞損害是引起腎小球性蛋白尿重要的病理因素，與多種腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。臨床常見的原發(fā)性或繼發(fā)性CKD，均伴有不同程度的足細胞損傷。因此，有關(guān)足細胞保護的研究在各型CKD的防治工作中都顯得尤為重要，是CKD早期防治工作的重點[2]。

我們前期的研究中通過芯片篩查證實狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)患者中存在miRNA表達異常，擴大樣本驗證后發(fā)現(xiàn)異常升高的miR-130b與患者24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)性[3]，但miR-130b在足細胞損傷中的作用尚不明確。本研究中，我們通過嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)誘導(dǎo)足細胞體外損傷模型，并使用微小RNA抑制劑(inhibitor)觀察miR-130b在足細胞損害中的作用以及機制。

材料和方法

一、實驗材料

主要試劑PAN購自美國Sigma，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鬼筆環(huán)肽(上海翊圣生物科技有限公司)，RPMI-1640細胞培養(yǎng)液(美國Gibco公司)。miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA實時定量PCR試劑盒、Lipofectamine RNAiMax和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、MiR-130b和內(nèi)參U6特異性探針引物(美國Life Technologies)；MiR-130b抑制劑和模擬物(mimic/inhibitor)及各自對照(NC)(廣州瑞博生物有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和Psicheck-2載體(美國Promega)；過氧化物增殖受體協(xié)同因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC1α)多克隆抗體、突觸足蛋白抗體(Synaptopodin)多克隆抗體(美國Proteintech)，腎病蛋白(Nephrin)單克隆抗體(美國abcame)，GAPDH抗體(美國CST)。胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、PVDF膜及ECL超敏發(fā)光劑(上海碧云天)。條件永生化溫度敏感小鼠足細胞系MPC5由東南大學附屬中大醫(yī)院張光遠博士饋贈，本實驗室長期保存。

二、方法

1.足細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 足細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，先于33 ℃、10 μg/mL的重組小鼠γ干擾素誘導(dǎo)下增殖，待其長至約70%～80%融合時，使用0.05%胰蛋白酶消化細胞后傳代并置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)10～14 d使其分化成熟。按照Lipofectamine RNAiMax轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染：分化成熟的足細胞轉(zhuǎn)染前更換Opti-MEM培養(yǎng)基，按照說明書分別配置A、B液及轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miR-130b inhibitor或?qū)φ?NC)inhibitor(50 nM)。轉(zhuǎn)染6 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實驗主要分組：(1)PAN組：轉(zhuǎn)染NC inhibitor 6 h后予以溶于二甲基亞砜(DMSO)的PAN(100 μg/mL)干預(yù)24 h；(2)PAN+miR-130b inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor 6 h后予以PAN干預(yù)24 h；(3)DMSO(對照)組：予以等量DMSO干預(yù)。

2.實時定量PCR MiRNA提取步驟按照試劑盒說明書，將總RNA產(chǎn)物溶解于無RNA酶水中。以RNA作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系5 μL，條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。實時定量PCR體系10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。2610318N02Rik實時定量PCR，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實時定量PCR體系10 μL，引物由上海生工合成，RIK序列為：正5’-CGCCTACCTGGATCTTCCAC-3’，反5’-CCAGACATGGGCTCACCAAT-3’，反應(yīng)條件同上。其中miR-130b檢測是用U6作為內(nèi)參，RIK基因表達使用GAPDH作為內(nèi)參。根據(jù)所得CT值，運用2-ΔΔCT相對定量法分別計算目的基因相對表達量。每個樣本做3個復(fù)孔，取平均值。

3.足細胞骨架染色 按照試劑盒說明書使用PBS配置鬼筆環(huán)肽工作液(100 nM)，吸掉培養(yǎng)液，37 ℃預(yù)熱的PBS清洗細胞2次，0.5% Triton X-100溶液透化處理5 min，F(xiàn)ITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液溫避光孵育30 min，含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察。

4.蛋白免疫印跡(Western blot)檢測 棄去細胞培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，加入200 μL含1% PMSF的細胞裂解液，刮取所有細胞，室溫12 000 rpm離心15 min，進行蛋白濃度定量并配成統(tǒng)一濃度。加入1/4體積5×上樣緩沖液，沸水中加熱10 min。以穩(wěn)定電壓100 V轉(zhuǎn)膜100 min，分別加入各種一抗，4 ℃過夜，PBST漂洗15 min，重復(fù)3次。加入HRP標記的相應(yīng)二抗，37 ℃孵育60 min，PBST漂洗3次后用超敏ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光檢測，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

5.足細胞凋亡檢測 用胰酶消化足細胞后離心，收集。冷PBS漂洗3次，1 000 g、4 ℃離心5 min。按照Annexin V/PI試劑盒說明書進行操作，重懸細胞，加入5 μL FITC標記的膜聯(lián)蛋白V(FITC-Annexin V)和5 μL碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光20 min，使用300目的過濾網(wǎng)過濾后，立即用流式細胞儀檢測，細胞分為4個象限：左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡和死亡細胞，左上象限為機械損傷細胞。

6.靶基因驗證 通過生物信息學網(wǎng)站targetscan 7.2在線預(yù)測出miR-130b與PGC1α mRNA的3端非編碼區(qū)(3’UTR)之間存在保守的結(jié)合位點。構(gòu)建PGC1α 3’UTR野生型(wt-PGC1α-3’UTR)及結(jié)合位點突變型載體(mut-PGC1α-3’UTR)，分別將miR-130b mimic及其對照物NC mimic與各載體共轉(zhuǎn)染足細胞。本部分實驗共分4組：(1)NC mimic+mut-PGC1α-3’UTR組；(2)NC mimic+wt-PGC1α-3’UTR組；(3)miR-130b mimic+wt-PGC1α-3’UTR組；(4)miR-130b mimic+mut-PGC1α-3’UTR組。24 h后收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明，檢測細胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、嘌呤霉素氨基核苷對PGC1α、miR-130b及宿主基因2610318N02Rik(RIK)表達的影響

如圖1所示，隨著PAN干預(yù)的濃度增加，足細胞內(nèi)PGC1α蛋白表達減少(圖1A)；而miR-130b表達上升，其中50 μg/mL與100 μg/mL組與對照組相比，差異均有意義(P<0.05，圖1B)。同時，相似的表達趨勢也見于宿主基因RIK(P<0.05，圖1C)。

二、抑制miR-130b對于足細胞裂孔膜蛋白及PGC1α表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，PAN組的足細胞裂孔膜蛋白(synaptopodin和nephrin)及潛在靶基因(PGC1α)的表達明顯降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor足細胞組與單純PAN干預(yù)組比較，synaptopodin、nephrin及PGC1α表達上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

三、抑制miR-130b對于足細胞骨架排列的影響

鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果如圖3所示，PAN組足細胞骨架出現(xiàn)紊亂、重組以及降解，并向邊緣聚集；與PAN組相比，PAN+miR-130b inhibitor組的足細胞骨架紊亂明顯好轉(zhuǎn)，在細胞內(nèi)部可見排列有序的足細胞骨架。

圖1 嘌呤霉素氨基核苷對PGC1α、miR-130b及RIK表達的影響(A.PGC1α蛋白，B.miR-130b，C.RIK基因)；與對照組比較，aP<0.05

四、抑制miR-130b對于足細胞凋亡的影響

各組足細胞凋亡如圖4所示，與對照組比較，PAN干預(yù)24 h后可誘導(dǎo)足細胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義(0.78%±0.45% vs 23.67%±3.06%，P<0.01)。PAN+miR-130b inhibitor組與PAN組相比，細胞凋亡減少(23.67%±3.06% vs 15.47%±1.74%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。

五、miR-130b對于足細胞PGC1α表達的影響

Western blot結(jié)果見圖5A，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-130b mimic 24h后可以下調(diào)PGC1α的蛋白表達(P<0.05)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果見圖5B，miR-130b mimic+wt-PGC1α-3’UTR組與NC mimic+wt-PGC1α-3’UTR組比較，熒光強度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而miR-130b mimic+mut-PGC1α-3’UTR組與NC mimic+mut-PGC1α-3’UTR組比較，熒光強度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：與DMSO組比較，aP<0.05；與PAN+miR-130b inhibitor組比較，bP<0.05圖2 抑制miR-130b對于足細胞裂孔膜蛋白表達的影響

圖3 抑制miR-130b對于足細胞骨架排列的影響

注：與DMSO組比較，aP<0.05；與PAN+NC inhibitor組比較，bP<0.05圖4 miR-130b對于足細胞凋亡的影響

討 論

足細胞損傷機制極其復(fù)雜，多種理化、生物因素均可影響足細胞的功能。近年來，隨著表觀遺傳學的研究深入，表觀遺傳缺陷在足細胞損害中的作用也越來越受到學界關(guān)注。PAN是嘌呤霉素的衍生物，具有選擇性的腎損害作用，PAN所致的腎臟損傷與人類腎病損傷一致，早期表現(xiàn)為細胞足突融合和消失的微小病變，隨著PAN作用時間的延長和蓄積量的增加，足細胞凋亡增加，進一步發(fā)展為局灶節(jié)段性腎小球硬化。而PAN作用的靶細胞即為足細胞，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)PAN干預(yù)后足細胞裂孔膜蛋白表達降低、骨架重排降解、凋亡增加。而伴隨PAN作用濃度的提高，我們也發(fā)現(xiàn)足細胞內(nèi)miR-130b表達升高，這個結(jié)果初步提示miR-130b可能參與了PAN誘導(dǎo)的足細胞損傷。而宿主基因RIK的表達也被證實伴隨上升(圖1C)，這個結(jié)果提示，PAN可能可以直接促進RIK的轉(zhuǎn)錄而上調(diào)miR-130b的表達。但具體機制尚不明了，在未來的研究中我們將繼續(xù)深入。

圖5 PGC1α是miR-130b的靶基因(A.miR-130b對于足細胞PGC1α蛋白表達的影響，與轉(zhuǎn)染NC mimic組比較，aP<0.05；B.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-130b與PGC1α靶向關(guān)系，與其余3組比較，aP<0.05)

目前尚無關(guān)于miR-130b與足細胞損傷相關(guān)的報道。已知的miR-130b的功能主要集中在腫瘤生物行為學、代謝性疾病及衰老的相關(guān)性研究。我們注意到Wang等[4]的研究結(jié)果顯示肥胖小鼠模型和中國人中循環(huán)miR-130b水平升高，且與身體質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)，與三酰甘油水平相比，是代謝綜合征的一個更好的預(yù)測因子；進一步研究顯示這些升高的miR-130b能以肌細胞作為靶點，降低肌細胞靶基因PGC1α表達，在肌肉脂肪氧化中起關(guān)鍵作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-130b可以通過抑制腎小管上皮細胞內(nèi)的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)而參與腎臟纖維化的進展[5]。在本研究中，我們也證實，隨著PAN作用濃度增加，PGC1α在足細胞的中的表達也進一步降低(圖1A)，提示升高的miR-130b可能參與了對于PGC1α的調(diào)節(jié)。

PGC1α與PPARγ都是重要的腎臟保護因子，并影響機體與細胞多種生命活動，包括誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡、抗炎反應(yīng)、調(diào)控脂肪、糖代謝、能量平衡，抑制腫瘤血管生成、抗肝纖維化作用、抗動脈粥樣硬化、降血脂和降血壓、改善心功能衰竭等[6-7]。在CKD的研究中，人們發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑能夠降低醛固酮誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型腎臟中ET-1、COX-2及TGF-β1的過表達，發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用[8]。相似的腎臟保護作用也被證實存在于小鼠腎缺血/再灌注損傷的模型中[9]。而激活PGC1α也被證明可以減少高糖環(huán)境下引起的足細胞骨架排列紊亂、表達減少，進一步研究顯示主要通過抑制線粒體自由基合成，改善呼吸鏈復(fù)合物活性，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡通路的激活[10]。在本研究中結(jié)果顯示抑制miR-130b表達可以有效緩解PAN誘導(dǎo)足細胞裂孔膜蛋白下降、細胞骨架重排及凋亡發(fā)生率，并同時提高PGC1α表達。進一步通過Western blot及雙熒光素報告酶系統(tǒng)檢測證實miR-130b在足細胞損傷中的作用可能與其可以抑制PGC1α表達相關(guān)。

綜上所述，miR-130b可能通過靶向抑制PGC1α表達進而參與足細胞的損傷，而抑制miR-130b的表達對足細胞保護具有積極意義。