西地那非對Caco-2細(xì)胞增殖及對NCM460細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

單靜博，郭沛艷，陳特長，汪云陽，李曉祺，周 颯，馬文建，2*

（1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2齊魯理工學(xué)院生物工程系，濟(jì)南250200）

近年來，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）已經(jīng)被列為全球第三大致命腫瘤，其發(fā)病率和病死率都持續(xù)增高［1］。全世界范圍內(nèi)每年有140萬例新的結(jié)直腸癌病例，其中有70萬患者死于結(jié)直腸癌［2］。絕大多數(shù)CRC與以下因素有關(guān)，如飲食、運(yùn)動、體重、食物傳播的誘變劑、特定的腸道菌群和慢性腸道炎癥等［3］。通常，炎癥性腸?。ㄈ鐫冃越Y(jié)腸炎或克羅恩病）患者發(fā)生結(jié)直腸癌的可能性比正常人高2～5倍［4-5］。根據(jù)流行病學(xué)研究，長期使用消炎藥可以降低消化道腫瘤患者的病死率［6］。腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持也依賴于腸道微生物耐受性和炎癥狀態(tài)之間的平衡［7］。

利用植物來源的化合物、維生素和營養(yǎng)補(bǔ)充劑進(jìn)行的化學(xué)預(yù)防被認(rèn)為是傳統(tǒng)的腫瘤預(yù)防方法，但近年來，基于炎癥在各種腫瘤形成過程中所發(fā)揮的作用，人們對其化學(xué)預(yù)防進(jìn)行了更廣泛的探索。結(jié)直腸癌作為一種常見的上皮性腫瘤，潛伏期近20年，在這段較長的時間內(nèi)，化學(xué)預(yù)防對于抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移可發(fā)揮作用［8-9］。氧化應(yīng)激是目前已知的CRC的病因，通過DNA損傷和癌基因突變以及腫瘤細(xì)胞增殖途徑而激活［10-11］。同時氧化應(yīng)激是細(xì)胞與組織的氧化和抗氧化系統(tǒng)之間失衡及氧化自由基和相關(guān)活性氧過量產(chǎn)生的結(jié)果［10］。外源性天然抗氧化劑具有抗炎作用，可用于化學(xué)預(yù)防CRC［12-15］。

在人體內(nèi)，與鄰近正常組織細(xì)胞相比，5型磷酸二酯酶（PDE5）在結(jié)腸癌、膀胱癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等多種腫瘤中表達(dá)量相對較高［16］。西地那非（sildenafil）作為 PDE5的選擇性抑制劑，因其是第1個口服治療男性勃起功能障礙藥物而被人們所知。其結(jié)構(gòu)與環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）結(jié)構(gòu)相似，通過與PDE5競爭性結(jié)合后，可顯著提高cGMP水平，激活蛋白激酶G（PKG），PKG激活A(yù)MPK和SIRT1，隨后通過增強(qiáng)PGC-1α的活性［17］，誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，從而抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生［18］。這些研究表明 PDE5可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用，靶向PDE5可能是一種有廣泛前景的抗腫瘤方法。西地那非能抑制ROS的產(chǎn)生，或許可用于化學(xué)預(yù)防CRC。大量的研究表明，通過外源性ROS可以探究氧化應(yīng)激的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞毒性反應(yīng)［19］，但外源性ROS引起的氧化損傷難以直接產(chǎn)生生理狀態(tài)下細(xì)胞所發(fā)生的生理反應(yīng)。甲萘醌（menadione）是一種多環(huán)芳香族酮，可作為維生素K合成的前體，通過氧化還原體系不斷在細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生ROS，較高濃度的甲萘醌可誘發(fā)與組織損傷、線粒體DNA損傷和細(xì)胞死亡相關(guān)的氧化應(yīng)激［20-22］。由于甲萘醌在細(xì)胞內(nèi)可建立內(nèi)源性ROS，更易觀察生理狀態(tài)下細(xì)胞所發(fā)生的生理反應(yīng)，因此本實驗以西地那非為研究對象，以甲萘醌誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞為腸道細(xì)胞炎癥模型，探討西地那非抵抗腸道炎癥的作用，并研究其對腸道益生菌干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌的生長影響，為其發(fā)揮腸道保護(hù)作用及預(yù)防結(jié)直腸癌作用提供實驗依據(jù)及理論參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

西地那非（上海源葉生物科技有限公司）；甲萘醌（美國Selleck Chemicals公司）；活性氧檢測試劑盒、一氧化氮檢測試劑盒、NG-L-硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；eNOS抗體（北京ImmunoWay公司）；p-eNOS抗體（天津市萊博科技有限公司）；p-JNK1／2抗體、p-ERK1／2抗體、p62抗體（上海 Abcam公司）；IL-1β抗體、IL-6抗體、TNF-α抗體（美國 Proteintech公司）；β-actin抗體（美國Signalway Antibody公司）。

1.2 儀 器

CMax Plus光吸收型單功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；紫外分光光度計（北京普析通用有限公司）；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 細(xì) 胞

人源結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460（上海慧穎生物科技有限公司）；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，本實驗室保存）；人源結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2（中科院干細(xì)胞庫／干細(xì)胞技術(shù)平臺）；鼠李糖乳桿菌CICC6141（Lactobacillus rhamnosus CICC6141，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）。

2 方 法

2.1 西地那非和甲萘醌的配制

避光條件下分別稱取一定量的西地那非和甲萘醌固體粉末于EP管中，加入DMSO，搖晃使之充分溶解，使母液濃度為100 mmol／L，過膜除菌后分裝于4℃保存。

2.2 西地那非對NCM460、Caco-2細(xì)胞增殖的影響

將NCM460、Caco-2細(xì)胞分別接種于96孔板下，5%CO2，37℃下過夜孵育，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時，設(shè)對照組和實驗組進(jìn)行實驗，對照組不加西地那非，實驗組用 10、20、40、80μmol／L西地那非分別處理細(xì)胞24 h，MTT法檢測細(xì)胞增殖的能力:每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg／mL MTT溶液20μL，37℃培養(yǎng)箱避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸收度。

2.3 西地那非對腸道細(xì)胞內(nèi)NO及ROS水平的影響

將對數(shù)生長期的NCM460、Caco-2細(xì)胞分別接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁生長后，設(shè)對照組和實驗組進(jìn)行實驗。對照組不加西地那非，實驗組選取40μmol／L西地那非處理細(xì)胞24 h，隨后棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3次。分別采用DAF-FM DA探針和DCFH-DA探針法檢測細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平:避光條件下，加入稀釋好的探針250μL，置于37℃培養(yǎng)箱孵育20 min后，棄掉熒光探針，用PBS洗滌3～5次，于共聚焦顯微鏡下分別選取激發(fā)波長495和488 nm進(jìn)行觀察，并拍照記錄結(jié)果，檢測細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平。

2.4 西地那非對 Caco-2細(xì)胞中 eNOS／ERK／JNK通路的影響

將對數(shù)期的Caco-2細(xì)胞接種在6孔板中，至細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上，棄掉上清，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 mL，設(shè)對照組、西地那非組、聯(lián)合給藥組，其中對照組不加藥，西地那非組只加入西地那非（終濃度40μmol／L），聯(lián)合給藥組加入西地那非（終濃度40μmol／L）與 eNOS抑制劑 L-NAME（終濃度100μmol／L）的混合液，各組分別處理細(xì)胞24 h，用預(yù)冷的 PBS清洗3次。Western blot檢測各組eNOS、p-eNOS、p-JNK1／2及 p-ERK1／2蛋白表達(dá)水平:每孔加入蛋白裂解液150μL，收集蛋白，將經(jīng)過煮沸、冷卻后離心的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（電泳參數(shù):80 V、30 min；120 V、90 min），之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉溶液將轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜（NC膜）封閉1 h，TBS溶液洗滌3次，4℃條件下與相應(yīng)一抗過夜孵育15 h以上。之后回收一抗，PBS洗滌3次，加入二抗（1∶5 000）5 mL于常溫條件下避光孵育2 h，重復(fù)洗滌，將NC膜平鋪于Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)中，設(shè)置程序，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Image J軟件分析灰度值。

2.5 甲萘醌誘導(dǎo)腸道細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型

將對數(shù)生長期的NCM460細(xì)胞接種6孔板。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時，設(shè)對照組和實驗組進(jìn)行實驗，對照組不加甲萘醌，實驗組用5、10、20μmol／L甲萘醌分別處理細(xì)胞24 h，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，采取DCFH-DA探針，通過激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平。為驗證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性，增加藥物處理濃度，同樣設(shè)對照組和實驗組進(jìn)行實驗，對照組不加甲萘醌，實驗組用 2.5、5、10、20μmol／L甲萘醌分別處理NCM460細(xì)胞24 h，用Western blot檢測NCM460細(xì)胞各組p62蛋白表達(dá)水平。在分子水平上，為進(jìn)一步證明甲萘醌可誘導(dǎo)腸道細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，設(shè)對照組和實驗組進(jìn)行實驗，對照組不加甲萘醌，實驗組用5、10μmol／L甲萘醌分別處理細(xì)胞24 h，用Western blot檢測NCM460細(xì)胞各組相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平。

為證明甲萘醌可以誘導(dǎo)腸道細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型，除NCM460細(xì)胞外，進(jìn)一步驗證甲苯醌也能引起結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，以此確定實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。將Caco-2細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時，設(shè)對照組和實驗組進(jìn)行實驗，對照組不加甲萘醌，實驗組加入10μmol／L甲萘醌處理細(xì)胞24 h，用DCFH-DA探針，通過共聚焦顯微鏡檢測各組ROS水平。用Western blot檢測Caco-2細(xì)胞各組p62蛋白表達(dá)水平及相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平。

2.6 西地那非對甲萘醌誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞炎癥模型的影響

將NCM460細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板及6孔培養(yǎng)板中，設(shè)對照組、甲萘醌組、甲萘醌＋西地那非組。其中對照組不加藥，甲萘醌組只加入甲萘醌（終濃度10μmol／L），甲萘醌＋西地那非組加西地那非（終濃度 40μmol／L）與甲萘醌（終濃度10μmol／L）的混合液。各組處理細(xì)胞 24 h后，MTT法檢測各組細(xì)胞活性。采用DCFH-DA探針，通過共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測各組ROS水平。Western blot檢測各組p62蛋白表達(dá)水平及相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平。

2.7 西地那非對兩種腸道益生菌生長的影響

取干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的菌液各2 mL，分別接種至MRS液體培養(yǎng)基100 mL中，各自設(shè)實驗分組為對照組和實驗組。對照組不加藥，實驗組用250、500μmol／L西地那非處理，每組實驗設(shè)3個平行，37℃搖床培養(yǎng)，在第 0、2、4、6、8、12、24、36 h時，采用紫外分光光度計在600 nm波長處測定各組吸收度，取平均值。以菌體懸液的吸收度（A）為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，分別繪制干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的生長曲線圖。

2.8 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各項指標(biāo)均以±s表示，使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗比較各組間顯著性差異，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 西地那非對NCM460、Caco-2細(xì)胞增殖的影響

用不同濃度的西地那非分別作用NCM460、Caco-2細(xì)胞24 h后，MTT檢測結(jié)果表明，西地那非對Caco-2細(xì)胞增殖的抑制效果比對結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460增殖的抑制效果更為顯著，由于80μmol／L西地那非對NCM460細(xì)胞仍有較強(qiáng)毒性作用，且10和20μmol／L西地那非對Caco-2細(xì)胞致死率均未過半，故選擇40μmol／L作為西地那非的處理濃度開展后續(xù)實驗（圖1）。

3.2 西地那非對腸道細(xì)胞內(nèi)NO及ROS水平的影響

由圖2所示，西地那非處理24 h后，可以增強(qiáng)NCM460細(xì)胞（圖2-A）及Caco-2細(xì)胞（圖2-B）內(nèi)的NO水平，同時降低胞內(nèi)ROS水平，提示西地那非有可能通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NO水平，抵抗腸道細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生。

Figure 1 Inhibition of sildenafil on the proliferation of NCM460 and Caco-2 cells（xˉ±s，n＝3）***P＜0.001 vs control group

3.3 西地那非對eNOS／ERK／JNK通路的影響

如圖3所示，西地那非處理Caco-2細(xì)胞24 h后，經(jīng)Western blot檢測，與對照組比較，西地那非組 Caco-2細(xì)胞中 eNOS、p-eNOS、p-JNK1／2及p-ERK1／2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。與西地那非組相比，西地那非與L-NAME聯(lián)合用藥組中eNOS、p-eNOS、p-JNK1／2及 p-ERK1／2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示西地那非對于結(jié)直腸癌的抑制效果可能與eNOS／ERK／JNK通路相關(guān)。

3.4 甲萘醌誘導(dǎo)腸道細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型

用不同濃度的甲萘醌處理NCM460細(xì)胞24 h，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察（圖4-A）及流式細(xì)胞術(shù)檢測（圖4-B），NCM460細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。Western blot檢測結(jié)果表明，甲萘醌可以上調(diào)NCM460細(xì)胞內(nèi)p62蛋白表達(dá)水平（圖4-C）及相關(guān)炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平（圖4-D）。為進(jìn)一步驗證以上實驗結(jié)果，用10μmol／L甲萘醌處理 Caco-2細(xì)胞24 h，激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果表明，甲萘醌可以誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞內(nèi) ROS水平升高（圖4-E）。Western blot檢測結(jié)果表明，甲萘醌可以上調(diào)Caco-2細(xì)胞內(nèi)p62蛋白表達(dá)水平及相關(guān)炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平（圖4-F）。以上結(jié)果表明甲萘醌可以通過誘導(dǎo)腸道細(xì)胞建立炎癥模型。

3.5 西地那非對甲萘醌誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞炎癥模型的影響

與甲萘醌組相比，MTT實驗結(jié)果表明，甲萘醌＋西地那非組可降低甲萘醌對細(xì)胞的毒性（圖5-A）。激光共聚焦顯微鏡（圖5-B）及流式細(xì)胞術(shù)檢測（圖5-C）結(jié)果表明，甲萘醌＋西地那非組可降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。Western blot檢測結(jié)果表明，甲萘醌＋西地那非組下調(diào)了p62、IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)水平（圖5-D）。表明西地那非可緩解甲萘醌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥，減輕甲萘醌對腸上皮細(xì)胞的毒性。

Figure 2 Effect of sildenafil on the level of ROSand NO in intestinal cells A:NCM460 cells；B:Caco-2 cells

Figure 3 Effect of sildenafil on the eNOS／ERK／JNK pathway in Caco-2 cells（xˉ±s，n＝3）A:Expressions of eNOS，p-eNOS，p-JNK1／2，p-ERK1／2 in Caco-2 cells detected by Western blot；B，C，D，E:Quantitative analysis of protein levels of eNOS，p-eNOS，p-JNK1／2，p-ERK1／2a:Control；b:Sildenafil；c:Sildenafil＋NG-nitro-L-arginine methyl ester***P＜0.001 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001 vs sildenafil group

Figure 4 Menadione induced intestinal cells to establish an inflammatory model（xˉ±s，n＝3）A:Effect of menadione on the level of ROSin NCM460 cells detected by laser scanning confocal microscopy（LSCM）；B:Quantitative analysis of the level of ROSin NCM460 cells by flow cytometry（**P＜0.01，***P＜0.001 vs control group）；C，D:Effect of menadione on the expressions of p62（C）and IL-1β，IL-6 and TNF-α（D）in NCM460 cells detected by Western blot；E:Effect of menadione on the level of ROSin Caco-2 cells detected by LSCM；F:Effect of menadione on the expressions of p62，IL-1β，IL-6 and TNF-αin Caco-2 cells detected by Western blot

Figure 5 Effects of sildenafil on inflammatory model of NCM460 cells induced by menadione（xˉ±s，n＝3）A:Cell proliferation detected by MTT；B:Levels of ROS detected by LSCM；C:Quantitative analysis of levels of ROS detected by flow cytometry；D:Expression of p62，IL-1β，IL-6 and TNF-αdetected by Western blot a:Control；b:Menadione；c:Menadione＋Sildenafil***P＜0.001 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs menadione group

3.6 西地那非對兩種腸道益生菌生長的影響

將不同濃度的西地那非處理干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌36 h，結(jié)果表明加入高濃度西地那非對干酪乳桿菌（圖6-A）和鼠李糖乳桿菌（圖6-B）的生長并無明顯影響，證明了西地那非可能在不影響腸道菌群穩(wěn)態(tài)的情況下，發(fā)揮抑癌效果。

Figure 6 Effects of sildenafil on the growth of Lactobacillus casei（A）and Lactobacillus rhamnosus（B）

4 討 論

Sharman等［23］研究發(fā)現(xiàn)西地那非可以顯著降低小鼠患結(jié)直腸癌的風(fēng)險。同時有研究表明NO可通過上調(diào)p-ERK1／2的表達(dá)水平誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［24］。本研究結(jié)果表明，西地那非對正常結(jié)腸上皮細(xì)胞無明顯毒性，但是對于Caco-2細(xì)胞有明顯的抑制作用，同時西地那非可以提高腸道細(xì)胞內(nèi)NO水平，通過上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的蛋白表達(dá)水平，激活磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK1／2）及磷酸化c-Jun氨基末端激酶 1／2（p-JNK1／2），這可能是西地那非抑制Caco-2細(xì)胞生長的主要原因。

有研究表明，西地那非存在抗炎潛能［25］。本研究證明西地那非可降低腸道細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，進(jìn)而降低結(jié)直腸癌發(fā)生的概率。當(dāng)外界不良因素進(jìn)入人體會影響免疫系統(tǒng)和胃腸道細(xì)胞，在分子水平上觸發(fā)與炎癥相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑，同時誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的反式激活，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1β）和白細(xì)胞介素6（IL-6），其表達(dá)增加可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡。p62是一種多功能、應(yīng)激誘導(dǎo)的支架蛋白，參與多種細(xì)胞過程，包括自噬清除、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)和氧化還原穩(wěn)態(tài)，研究證明p62與線粒體功能和炎性小體活化有關(guān)［26］。本研究采用甲萘醌處理 NCM460細(xì)胞及Caco-2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)甲萘醌可劑量依賴性地升高細(xì)胞內(nèi) ROS水平，同時上調(diào) p62、IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表達(dá)水平，因此建立了甲萘醌誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的炎癥模型，這對今后模擬外界環(huán)境因素誘導(dǎo)腸道炎癥模型提供了實驗參考。最后本研究發(fā)現(xiàn)西地那非與甲萘醌聯(lián)合作用于細(xì)胞，可減緩甲萘醌對細(xì)胞的毒性，進(jìn)一步證明了西地那非可以有效地改善腸道細(xì)胞炎癥反應(yīng)，通過抵抗外界條件引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生。

有研究證明干酪乳桿菌［4，27］和鼠李糖乳桿菌［28-30］都具有抗炎及維持腸道菌群平衡的作用。本研究證明西地那非對干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的生長無不良影響。這些結(jié)果提示西地那非可能在不破壞菌群平衡的狀態(tài)下，能夠有效地改善腸道細(xì)胞炎癥反應(yīng)，通過改善外界條件引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生。