復(fù)方薏荷茶對肥胖小鼠改善胰島素抵抗的調(diào)節(jié)機制研究

郭聰穎，楊松林，王 軍，廖瑋濤，莫凌峰，周丹水，倪維鞠，曾 宇，4*

（1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2廣州安諾科技股份有限公司，廣州510530；3長沙畢基卡莫醫(yī)學(xué)科技有限公司，長沙410007；4廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州510080）

隨著人們生活水平的提高，肥胖問題已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共健康問題。肥胖患者患高血脂、高血糖等疾病的風(fēng)險大大增加，并且肥胖患者伴有的胰島素抵抗癥狀會使機體葡萄糖代謝紊亂，是引發(fā)糖尿病的重要原因之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖可能使肝臟和脂肪組織中胰島素受體對胰島素的敏感性降低，進(jìn)而影響脂肪組織中的胰島素代謝下游通路PI3K-Akt-GLUT4中GLUT4對葡萄糖的轉(zhuǎn)運作用，造成葡萄糖代謝失衡引起血糖升高［2］。胰島素抵抗還會加重肝細(xì)胞中脂質(zhì)的沉積，造成肝損傷［3］。復(fù)方薏荷茶主要由薏苡仁、荷葉、山楂、陳皮和決明子5種中藥材組成，與單味藥不同，復(fù)方藥物可以通過藥物之間協(xié)同或拮抗的作用達(dá)到增效減毒的功效。在復(fù)方薏荷茶中，薏苡仁為君藥，可利水滲濕、行氣健脾；荷葉和山楂作為臣藥，升發(fā)清陽；佐以陳皮和決明子，燥濕祛痰、理氣健脾。該復(fù)方主旨藥食同源，諸藥協(xié)同達(dá)到滲濕濁、補中氣的作用。本實驗通過高脂飲食誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗癥狀，觀察復(fù)方薏荷茶對肥胖小鼠導(dǎo)致的胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用。

1 材 料

1.1 藥材與試劑

復(fù)方薏荷茶，主要配方為:薏苡仁、荷葉、山楂、陳皮和決明子，由湖南土家族醫(yī)莫氏研發(fā)，經(jīng)長沙畢基卡莫醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)。HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；油紅O染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；PI3K，p-Akt，Akt抗體（美國 CST公司）；GLUT4抗體（英國Abcam公司）。

1.2 儀 器

ASP200S石蠟脫水機、Historore ArcadiaH石蠟包埋機、RM2235石蠟切片機、DMI3000B顯微鏡（德國Leica公司）；血糖儀、血糖試紙（江蘇省魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；ZY-1200M自動生化儀（上海市科華生物工程股份有限公司）。

1.3 動 物

SPF級4周齡雄性C57BL／6J小鼠32只，體質(zhì)量為15～17 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK（粵）2013-0002。實驗獲得廣東藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.4 動物飼料

空白組給予正常標(biāo)準(zhǔn)飼料（脂肪含量10%），其余組給予高脂飼料（脂肪含量37%；52.2%基礎(chǔ)飼料，20%蔗糖，15%豬油，1.2%膽固醇，0.2%膽酸鈉，10%酪蛋白，0.6%磷酸氫鈣，0.4%石粉，0.4%預(yù)混飼料）飼養(yǎng)。飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

2 方 法

2.1 藥品的配制

精密稱取復(fù)方薏荷茶100 g，置入2 000 mL燒杯，加自來水1 000 mL，煎煮30 min，用紗布過濾得濾液。取濾渣，再置入燒杯，加自來水1 000 mL，煎煮30 min，用紗布過濾，合并兩次濾液，濃縮至500 mL，得高濃度復(fù)方薏荷茶0.2 g／mL的原液備用。低濃度復(fù)方薏荷茶配制成0.1 g／mL供低濃度組使用。

2.2 動物分組造模與給藥

將小鼠用標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常組（NFD，n＝8）、高脂飼料造模組（n＝24）。喂養(yǎng)到第6周，將3籠高脂飼料造模組的小鼠體質(zhì)量和血糖分別與空白組進(jìn)行單因素方差分析，若P＜0.05，證明肥胖模型造模成功，剔除不成模的小鼠。將造模成功的小鼠隨機分成模型組（HFD）、復(fù)方薏荷茶低濃度組［20 mg／（kg·d）］（YH-L）和復(fù)方薏荷茶高濃度組［40 mg／（kg·d）］（YH-H），每組8只。空白組和模型組給予相同體積的生理鹽水，空白組給予普通；飼料模型組，復(fù)方薏荷茶低濃度組和復(fù)方薏荷茶高濃度組給予高脂飼料。

2.3 實驗指標(biāo)及測定

2.3.1 攝食量，體質(zhì)量及Lee′s指數(shù) 每天記錄小鼠的體質(zhì)量和攝食量。飼養(yǎng)12周后，小鼠禁食12 h，自由飲水，稱重，記錄體長（鼻尖至肛門的長度），計算 Lee′s指數(shù)。Lee′s指數(shù) ＝［體質(zhì)量（g）×1 000／體長（cm）］1／3。

2.3.2 空腹血糖 分別在喂養(yǎng)到第6周，第9周和第11周的時候?qū)⑿∈蠼? h后將小鼠尾部剪去2 mm，去掉尾靜脈流出的第1滴血，用醫(yī)用血糖試紙吸取第2滴測定小鼠的空腹血糖。

2.3.3 口服糖耐量 飼養(yǎng)到11周時，將小鼠禁食8 h，將小鼠尾剪去約2 mm后，去掉尾部靜脈流出的第1滴血，用醫(yī)用血糖試紙吸取第2滴測量尾靜脈血糖。取數(shù)值0 min的基礎(chǔ)血糖值，隨后各組小鼠分別灌胃葡萄糖溶液（2 g／kg），測定間隔時長為15、30、60、120 min的血糖含量，最后計算曲線下面積。

2.3.4 生物樣品的取材及生化指標(biāo) 給藥結(jié)束后，小鼠禁食12 h，自由飲水。進(jìn)行摘除眼球取血，將全血于1.5 mL離心管中常溫靜置30 min后，4℃，3 000 r／min離心 15 min，獲得血清，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙?，頸椎脫臼處死小鼠，于冰上快速取腎周脂肪、腸系膜脂肪及附睪周圍脂肪以及肝臟，用生理鹽水清洗組織后稱取濕重，將所有脂肪組織及部分肝臟組織放到凍存管中液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將另一部分小鼠肝組織置于4%多聚甲醛中4℃浸泡。全自動生化儀測定血清樣品中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量。

2.3.5 肝臟組織病理觀察 肝臟組織在4%多聚甲醛中浸泡48 h后取出，經(jīng)二甲苯和乙醇梯度脫水處理后用石蠟包埋切片，將切片于梯度乙醇和二甲苯中脫臘，然后肝臟組織切片用HE染料染色和油紅O染料染色，切片脫水處理后用中性樹膠封片，在正置顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

2.3.6 Western blot法檢測 PI3K、Akt、GLUT4的表達(dá)量 取附睪脂肪組織0.1 g，稱重后放入勻漿器中制成組織勻漿 12 000 r／min，4℃下離心15 min取上清液，BSA法測定蛋白濃度后調(diào)整每組蛋白濃度約為12μg／μL，-20℃保存蛋白提取液。每個電泳槽加入相同蛋白質(zhì)量的組織樣品用SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用5%的脫脂奶粉室溫下封閉PVPE膜，90 min后，在4℃條件下分別進(jìn)行抗體 GLUT4、PI3K、p-Akt、Akt和 GADPH的孵育過夜，第2天用PBST清洗PVEP膜后37℃孵育兔源二抗60 min，用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。

2.3.7 免疫組化法檢測肝臟中GLUT4的表達(dá)量

將肝組織的石蠟切片后進(jìn)行脫臘及抗原修復(fù)處理，然后用3%雙氧水37℃避光孵育25 min，用1%的BSA封閉60 min后，在4℃下孵育GLUT4一抗過夜，后滴加兔源二抗37℃孵育60 min，用DAB顯色液進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染3 min水洗后脫水，封片，在顯微鏡下鏡檢。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用IBM SPSSStatistics 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料表示方法為±s，采用單因素方差分析的方法進(jìn)行組間的顯著性比較。Image J軟件對Western blot和免疫組化結(jié)果進(jìn)行灰度半定量分析。將P＜0.05作為差異并且有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 對高脂血癥小鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

圖1-A顯示，經(jīng)過6周的高脂飼料飼養(yǎng)后，高脂飼料造模組的小鼠體質(zhì)量顯著高于正常組（P＜0.01），證明小鼠肥胖造模成功。6周后將高脂飼料造模組隨機分成模型組、復(fù)方薏荷茶高、低濃度組，進(jìn)行6周的灌胃給藥，復(fù)方薏荷茶低濃度小鼠體質(zhì)量與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，復(fù)方薏荷茶高濃度小鼠體質(zhì)量與模型組相比有顯著性差異（P＜0.01）。每日平均食物攝取量（圖1-C）結(jié)果顯示復(fù)方薏荷茶高濃度小鼠的飼料攝入量顯著低于模型組（P＜0.01）。而從（圖1-B）來看，各組之間Lee′s指數(shù)沒有顯著性差異。

Figure 1 Effect of Compound Yihe Tea on body weight（A），Lee′s index（B）and food intake（C）in obese C57BL／6Jmice（±s，n＝8）NFD:Normal fat diet group；HFD:High fat diet group；YH-L:Compound Yihe Tea low dosage group［20 mg／（kg·d）］；YH-H:Compound Yihe Tea high dosage group［40 mg／（kg·d）］＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs NFD group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs HFD group

3.2 對高脂血癥小鼠脂肪和肝臟濕重的影響

圖2-A結(jié)果顯示，C57BL／6J小鼠各部位脂肪組織（附睪脂肪、腎周脂肪、腸系脂肪、總脂肪）重量及總脂肪系數(shù)分析可得。模型組附睪脂肪重量顯著高于復(fù)方薏荷茶高、低濃度組（P＜0.001）?？傊镜闹亓浚谀Ｐ徒M與空白組以及復(fù)方薏荷茶高、低濃度組之間分別存在十分顯著的差異（P＜0.001）。總脂肪系數(shù)統(tǒng)計（圖2-B）顯示，模型組總脂肪系數(shù)遠(yuǎn)大于其他3組，且模型組和復(fù)方薏荷茶高、低濃度組相比具有顯著性的差異（P＜0.01）。在圖2-C和圖2-D中，復(fù)方薏荷茶高濃度組小鼠肝臟濕重和肝臟指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.01），復(fù)方薏荷茶高濃度組小鼠肝臟指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.01）。

3.3 對高脂血癥小鼠口服葡萄糖耐量和血糖的影響

對C57BL／6J小鼠第6周，第9周和第11周的血糖進(jìn)行測定分析，圖3-A結(jié)果顯示，在第6周高脂飼料造模組小鼠血糖水平顯著高于正常組小鼠的血糖水平（P＜0.05），表示造模成功。圖3-B表明在第12周時，復(fù)方薏荷茶低濃度組血糖水平低于模型組（P＜0.05），復(fù)方薏荷茶高濃度組血糖水平顯著低于模型組（P＜0.01）。從圖3-C結(jié)果中可知，在灌服葡萄糖15 min后復(fù)方薏荷茶高、低濃度組的血糖均比模型組顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。30 min后復(fù)方薏荷茶高、低濃度組血糖均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），在60 min和120 min時復(fù)方薏荷茶高濃度組與模型組相比血糖顯著降低（P＜0.01）。圖3-D通過計算葡萄糖耐量的曲線下面積，復(fù)方薏荷茶高濃度組的曲線下面積顯著低于模型組（P＜0.05）。

3.4 對高脂血癥小鼠血脂水平的影響

與模型組相比，圖4-A顯示低濃度和高濃度復(fù)方薏荷茶可顯著降低血清三酰甘油水平（P＜0.01，P＜0.001）。圖4-B顯示在復(fù)方薏荷茶低濃度和高濃度兩組中總膽固醇水平有下降的趨勢。圖4-C結(jié)果顯示，復(fù)方薏荷茶高濃度與模型組相比可顯著降低密度脂蛋白膽固醇水平（P＜0.01）。

3.5 對高脂血癥小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

圖5-A中HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠的肝組織在400倍視野下，很難以清晰地觀察到脂肪滴和脂肪滴聚集的存在。模型組肝細(xì)胞排列比較混亂，脂肪滴的數(shù)量過多及受聚集的脂肪滴擠壓的情況下。在400倍視野下，可以十分明顯地觀察到模型組的細(xì)胞數(shù)目比空白組少，除了聚集的脂肪滴外，更能清晰觀察到肝細(xì)胞內(nèi)部存在非常多細(xì)小的脂肪滴。與模型組相比較，復(fù)方薏荷茶高、低濃度組均具有顯著性地降低脂肪滴數(shù)目的作用和抑制肝臟脂化的作用，且高濃度的作用比低濃度明顯。圖5-B的油紅O染色結(jié)果顯示，模型組中脂肪著色明顯，在400倍的視野下，能清晰觀察到大量的脂肪滴脂肪顆粒。復(fù)方薏荷茶低濃度，高濃度組與模型組相比，切片內(nèi)的脂肪顆粒數(shù)量明顯減少，排布明顯更稀疏，能清晰觀察到細(xì)胞內(nèi)脂肪滴和脂肪顆粒的密度明顯比模型組低。

Figure 2 Effect of Compound Yihe Tea on organ weights in obese C57BL／6Jmice（xˉ±s，n＝8）A:White adipose tissue（WAT）weight；B:Total W index；C:Liver weights；D:Liver indexEpid W:Epididymis WAT；Peri W:Perirenal WAT；Mes W:Mesenteric WAT；Total W:Total weight of Epid W，Peri W and Mes W**P＜0.01，***P＜0.001 vs HFD group

Figure 3 Effect of Compound Yihe Tea on bloody glucose and glucose tolerance in obese C57BL／6J mice（xˉ±s，n＝8）A:Blood glucose levels at week 6，9 and 11；B:Blood glucose levels at week 12；C:Glucose tolerance test（OGTT）at week 11；D:Area under the cover（AUC）of OGTT at week 11*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs HFD group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs NFD group

Figure 4 Effect of Compound Yihe Tea on lipid metabolic parameters in obese C57BL／6J mice（xˉ±s，n＝8）A:Triglycerides（TG）；B:Total cholesterol（TC）；C:Low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）；D:High-density lipoprotein cholesterol（HDL-C）*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs HFD group

Figure5 Effect of Compound Yihe Tea on pathological liver changes HE staining（A）and oil red Ostaining（B）in obese C57BL／6Jmice（×400）

3.6 對高脂血癥小鼠附睪脂肪組織中PI3K，p-Akt，GLUT4蛋白表達(dá)的影響

與模型組相比，復(fù)方薏荷茶高濃度組PI3K蛋白的表達(dá)顯著性增加（P＜0.01）；復(fù)方薏荷茶高、低濃度組均可顯著性增強 p-Akt的表達(dá)（P＜0.001）；對GLUT4的表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果可知復(fù)方薏荷茶低濃度組高于模型組（P＜0.05），復(fù)方薏荷茶高濃度組顯著高于模型組（P＜0.01），見圖6。

Figure 6 Effect of Compound Yihe Tea on relative protein expression of PI3K／GADPH，p-Akt／Akt，GLUT4／GADPH in epididymis WAT A:Western blot bands of PI3K，p-Akt，Akt，GLUT4 and GADPH；B:Analysis of relative protein expression by software Image J（±s，n＝8）*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs HFD group

3.7 復(fù)方薏荷茶對高脂血癥小鼠肝臟組織中GLUT4蛋白表達(dá)的影響

用免疫組化法對肝臟組織GLUT4蛋白表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，模型組中GLUT4蛋白的表達(dá)量小于正常組（P＜0.05），復(fù)方薏荷茶高、低濃度組中 GLUT4蛋白表達(dá)量均高于模型組（P＜0.05），見圖 7。

Figure 7 Effect of Compound Yihe Tea on immunohischemistry stain of the GLUT4 in liver tissueA:IHC staining of livers with GLUT4（×400）；B:Analysis of protein expression on GLUT4 by software Image J（±s，n＝8）*P＜0.05 vs HFD group

4 討 論

本研究表明，復(fù)方薏荷茶可以有效提高肥胖模型小鼠的葡萄糖耐受能力，降低高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠的血糖水平。對小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)（TC、TG、HDL-C和LDL-C）的測定結(jié)果顯示，復(fù)方薏荷茶各組可以顯著降低實驗性肥胖C57BL／6J小鼠血清中TC水平，TG和LDL-C水平且效果與濃度呈正相關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)方薏荷茶對HDL-C水平的影響并不顯著，并且在針對HDL-C的研究中發(fā)現(xiàn)HDLC無論是過高還是過低都會增加高脂血癥的患病風(fēng)險［4］。因為TC水平過高已被認(rèn)為是心血管疾病的主要危險因素，LDL-C是降脂治療的主要目標(biāo)，而TG則成為另一個主要危險因素［5］。所以，復(fù)方薏荷茶能顯著性降低實驗性肥胖C57BL／6J小鼠血清中TC水平的同時，也一定程度地降低其LDL-C水平，能一定程度緩解脂代謝紊亂引起的動脈粥樣硬化病變，且上述作用效果與復(fù)方薏荷茶的某些有效成分濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

從脂肪組織的結(jié)果分析，給藥復(fù)方薏荷茶高濃度后能極顯著地減少實驗性肥胖C57BL／6J小鼠的附睪脂肪的重量和脂肪系數(shù)，并對肝組織濕重有一定的影響。復(fù)方薏荷茶可能具有促進(jìn)脂肪組織分解代謝和（或）抑制脂肪組織合成的有效成分。但從結(jié)果可知，該有效成分的作用效果可能與濃度無關(guān)，可能是因為該有效成分是通過激活與脂肪組織合成、分解代謝有關(guān)的受體和（或）酶，所以該有效成分的作用與受體和（或）酶的數(shù)目關(guān)系更為相關(guān)。對肝組織濕重的結(jié)果分析并結(jié)合肝組織的HE染色和油紅O染色的切片結(jié)果，復(fù)方薏荷茶可以顯著地緩解在高脂飲食誘導(dǎo)下C57BL／6J小鼠肝中油脂的蓄積現(xiàn)象，且復(fù)方薏荷茶高濃度組的作用比復(fù)方薏荷茶低濃度組明顯。所以復(fù)方薏荷茶通過減少臟組織中脂肪細(xì)胞的堆積從而減輕肝組織重量。

胰島素抵抗與脂肪和肝代謝有密切關(guān)系［6-7］。脂肪組織作為能量調(diào)節(jié)器可以通過調(diào)節(jié)白色脂肪的合成與釋放進(jìn)而調(diào)節(jié)能量的攝入和消耗［8］。PI3K-Akt-GLUT4通路是胰島素調(diào)節(jié)血糖的下游主要通路［9］，在肝和脂肪組織中胰島素可以通過激活胰島素受體（IRS）激活 PI3K［10］，研究中發(fā)現(xiàn)肥胖可以導(dǎo)致脂肪組織中PI3K與IRS相結(jié)合的蛋白表達(dá)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致PI3K活性下降［11］。GLUT4是一種細(xì)胞膜蛋白，它可以通過由膜內(nèi)到膜外的轉(zhuǎn)運增加葡萄糖的消耗［12］，胰島素入血后胰島素受體底物（IRS）被激活，進(jìn)而激活PI3K-Akt通路使得GLUT4的表達(dá)增加，并且會使含有GLUT4的胞內(nèi)囊泡移動到細(xì)胞膜上面，提高了胰島素對葡萄糖的利用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方薏荷茶可以增加小鼠附睪脂肪組織中PI3K-Akt-GLUT4蛋白的表達(dá)，從肝臟的免疫組化研究結(jié)果可知，復(fù)方薏荷茶同樣可以增加肝臟組織中GLUT4蛋白含量的表達(dá)，可以通過增加外周組織對葡萄糖的利用進(jìn)而達(dá)到降低血糖的目的。