養(yǎng)陰活血方對高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-／-小鼠Treg／Th17失衡及動脈粥樣硬化的影響

周李煜，馬元婧，孫玉婷，陳韋凱，邱潤澤，袁冬平，龍 軍

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210023）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）以血管內(nèi)壁脂質(zhì)沉積為特點，是多種心腦血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)［1］。自 Ross［2］提出 AS的炎癥免疫學(xué)說以來，炎癥和免疫在AS發(fā)展中的作用受到越來越多的重視［3］。脂質(zhì)與炎癥共同參與AS疾病進程，同時免疫平衡的破壞也加劇了AS的發(fā)展，其中CD4＋T細胞亞群調(diào)節(jié)性 T細胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T細胞17（helper T cell 17，Th17）之間的平衡已被證實是影響AS發(fā)生發(fā)展的重要因素［4］。脂質(zhì)、炎癥以及免疫平衡三者在AS中相互影響，是促進AS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

養(yǎng)陰活血方（YHF）源自江蘇省名老中醫(yī)唐蜀華教授，已于臨床治療AS多年，療效顯著。YHF由何首烏、黃精、紅花、姜黃、漏蘆以及虎杖六味中藥組成，對AS陰虛淤熱的特點綜合發(fā)揮補益肝腎、活血化瘀、清熱解毒的功效［5］。YHF對 AS的積極作用已在家兔、大鼠AS模型中得到充分證實，并已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂質(zhì)、保護血管內(nèi)皮功能以及抑制炎癥是其發(fā)揮功效的重要途徑［6］。

本課題組前期在高脂飲食誘發(fā)的ApoE-／-小鼠AS模型中發(fā)現(xiàn)，YHF可以改善AS癥狀，減輕炎癥水平，并上調(diào)外周血Treg比例［7］，由此推測YHF在調(diào)節(jié)AS小鼠Treg／Th17平衡中具有一定影響。本研究在此模型上進一步觀察YHF對AS小鼠Treg／Th17平衡的影響。此外，觀察YHF對LPS刺激的CD4＋T細胞中Treg和Th17細胞特征性轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3和 RORγt表達的影響。由此分析脂質(zhì)、炎癥以及Treg／Th17免疫失衡對 ApoE-／-小鼠AS發(fā)病的影響以及YHF的干預(yù)作用。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

養(yǎng)陰活血方配方組成:片姜黃、紅花、漏蘆、虎杖、制何首烏、酒黃精。養(yǎng)陰活血方的制備及有效成分檢測見前期報道［8］；辛伐他?。ê幽咸旆剿帢I(yè)有限公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）與高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）生化試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）；油紅O粉末（北京索萊寶科技有限公司）；抗小鼠CD4 FITC抗體、抗小鼠CD25 PE抗體、抗小鼠Foxp3 eFluor 660流式抗體（美國eBioscience公司）；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Master Mix-LR qRT-PCR染料法試劑盒（美國Ambion公司）；Foxp3兔抗鼠多克隆抗體、RORγt兔抗鼠多克隆抗體（英國Abcam公司）；小鼠CD4＋T細胞陰選試劑盒（美國Thermo Fisher公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Infinite M200PRO酶標儀（瑞士Tecan公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國 BD公司）；Nano-Drop One微量紫外-可見分光光度計（美國Thermo Fisher公司）；Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度反轉(zhuǎn)錄PCR儀、7500熒光實時定量PCR（qRT-PCR）儀（美國 Applied Biosystems公司）；Western電泳儀、GelDoc XR＋全自動凝膠成像儀（美國Bio-rad公司）；石蠟包埋機（日本Tissue-TEK公司）；蔡司倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；5417R冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.3 動 物

ApoE-／-小鼠，雄性，6～8周，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號:SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證:SYXK（蘇）2014-0001。C57BL／6小鼠，雄性，18～20 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號:SCXK（蘇）2017-0001。動物實驗符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 動物分組、造模與給藥

ApoE-／-小鼠分為正常組、模型組、辛伐他汀組、YHF低劑量組、YHF高劑量組，每組16只。正常組普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給以高脂飼料（含1.25%膽固醇，20%豬油）。辛伐他汀組給予辛伐他汀（3.3 mg／kg），YHF低劑量組給予 YHF（18 g／kg，以生藥計），高劑量組給予 YHF（36 g／kg，以生藥計），灌胃給藥20周。

2.2 細胞獲取與處理

無菌分離小鼠脾臟，研磨成單細胞懸液，紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心并清洗后，參照CD4＋T細胞分離試劑盒說明獲取 CD4＋T細胞，加入4μg／mL抗小鼠 CD28抗體、6μg／mL抗小鼠 CD3抗體，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

除對照組以外的其余各組細胞中加入0.1 μg／mL脂多糖（LPS）以在體外模擬炎性微環(huán)境，同時給藥組加入1，2，4 mg／L的 YHF水提液，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)檢測。

2.3 主動脈斑塊面積測定與血脂檢測

分離主動脈，油紅O脂肪染色。MapInfo 7.0（美國，www.mapinfo.com）軟件測量主動脈斑塊面積，計算斑塊占血管總面積比。血脂檢測按照試劑盒說明書步驟操作，非高密度脂蛋白膽固醇（non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDLC）＝TC-HDL-C。

2.4 流式細胞術(shù)檢測外周血Treg、Th17比例

淋巴細胞分離液獲取總淋巴細胞，固定緩沖液固定并用破膜緩沖液處理樣本。用于檢測CD4＋IL-17A＋Th17細胞的樣本加用佛波酯處理以刺激IL-17A分泌。相應(yīng)抗體孵育后檢測。

2.5 qRT-PCR檢測主動脈組織／小鼠脾臟CD4＋T細胞Foxp3和RORγt mRNA表達

TRIzol法提取總RNA。qRT-PCR操作及反應(yīng)條件按試劑盒說明書，引物委托上海生工合成，引物信息見表 1。數(shù)據(jù)按 2-ΔΔCt法（內(nèi)參 GAPDH）分析。

2.6 免疫組化檢測主動脈 Foxp3、RORγt蛋白表達

石蠟包埋小鼠主動脈，切片，F(xiàn)oxp3、RORγt抗體孵育后，加二抗溶液孵育；按IHC實驗步驟處理，最后于光學(xué)顯微鏡下進行觀察和圖像采集。

Table 1 Primers used in qRT-PCR and the sequences

2.7 Western blot檢測主動脈 Foxp3和 RORγt蛋白表達

RIPA裂解液提取蛋白，BCA法蛋白定量后，加入Loading buffer，沸水浴5 min完成蛋白變性。樣品以30μg的上樣量進行電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉，分別用一抗、二抗孵育，全自動凝膠成像儀獲取條帶圖像，Image Lab 4.0.1軟件分析。

2.8 免疫熒光法觀察小鼠脾臟 CD4＋T細胞Foxp3、RORγt蛋白表達

收集培養(yǎng)的細胞，滴在預(yù)冷的多聚賴氨酸包被玻片后置于細胞孵箱2～3 h，按免疫熒光實驗步驟處理加一抗、二抗。熒光顯微鏡觀察拍照。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行雙側(cè)t檢驗或One-Way ANOVA分析，GraphPad Prism 5.02軟件制圖，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 YHF對ApoE-／-小鼠主動脈斑塊及血脂水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠主動脈斑塊顯著增多，且主動脈弓處尤為明顯（P＜0.01，圖1-A和圖1-B）。與模型組相比，YHF低、高劑量組小鼠主動脈斑塊面積明顯減?。≒＜0.05）。YHF對AS小鼠血脂水平具有調(diào)節(jié)作用。與正常組相比，模型組小鼠TC、TG、LDL-C與non-HDL-C水平升高，HDLC水平下降（P＜0.05，圖1-C）。與模型組相比，YHF低劑量降低TG水平，升高HDL-C水平；YHF高劑量則降低TC、TG與non-HDL-C水平并升高HDL-C水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，YHF能夠降低血脂水平，減少高脂飲食所致ApoE-／-小鼠的AS斑塊形成。

Figure 1 Effects of Yangyin Huoxue Prescription（YHF）on atherosclerotic plaque area and serum lipids level of ApoE-／-miceA:Aortas were separated from aortic arch to left and right common iliac artery and stained by oil Red O；B:Area of atherosclerotic plaque were measured by MapInfo 7.0（±s，n＝5）；C:Content of serum lipids including total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）and high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）of ApoE-／-mice were detected by biochemical kits，and the content of non-high density lipoprotein cholesterol（non-HDL-C）was calculated by HDL-C subtracted from TC content（±s，n＝6）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

3.2 YHF對 ApoE-／-小鼠外周血 Treg／Th17比例的影響

與正常組相比，模型組Treg比例下降（P＜0.01，圖2-A和圖2-B），Th17比例上升（P＜0.05，圖2-A和圖2-B），Treg／Th17降低（P＜0.01，圖 2-C）。與模型組相比，YHF低、高劑量組Treg比例升高（P＜0.01），Treg／Th17增加（P＜0.01）。結(jié)果表明，YHF一定程度上提高了高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-／-小鼠外周血中 Treg細胞比例，降低了Th17細胞比例。

3.3 YHF對 ApoE-／-小鼠主動脈 Foxp3、RORγt mRNA表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠主動脈Foxp3 mRNA表達下降（P＜0.001），RORγt mRNA表達上升（P＜0.001）。與模型組相比，YHF高劑量上調(diào)小鼠主動脈 Foxp3 mRNA表達（P＜0.01），下調(diào)RORγt mRNA表達（P＜0.05）。結(jié)果表明，YHF增加主動脈Foxp3 mRNA表達而降低RORγt mRNA表達（圖3）。

3.4 YHF對主動脈 Foxp3、RORγt蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠主動脈Foxp3蛋白表達下降（P＜0.01，圖4-A和圖4-B），RORγt蛋白表達增加（P＜0.001，圖4-A和圖4-B）。與模型組相比，YHF上調(diào)Foxp3蛋白表達（P＜0.001），下調(diào)RORγt蛋白表達（P＜0.01）。結(jié)果表明，YHF可以增加主動脈 Foxp3蛋白表達，降低 RORγt蛋白表達。

3.5 IHC檢測YHF對主動脈 Foxp3、RORγt蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠主動脈Foxp3蛋白表達下降（P＜0.05，圖5-A和圖5-B），RORγt蛋白表達增加（P＜0.05，圖5-A和圖5-B）。與模型組相比，YHF各組Foxp3蛋白表達均呈現(xiàn)上升趨勢，RORγt蛋白表達呈現(xiàn)下降趨勢，但高劑量組Foxp3蛋白表達上升更加明顯（P＜0.05）、低劑量組RORγt蛋白表達下降更加明顯（P＜0.05）。結(jié)果表明，YHF具有增加主動脈組織中Foxp3蛋白表達而降低RORγt蛋白表達的作用。

Figure 2 Effects of YHF on Treg or Th17 in peripheral blood of ApoE-／-mice（xˉ±s，n＝3）A:Peripheral blood of mice were collected at the end of 20th week and peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were obtained to detect the percentage of Treg or Th17；B:Frequency of Treg or Th17 in PBMC；C:Ratio of Treg／Th17*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs model group

Figure 3 Effects of YHF on mRNA expression of Foxp3 or RORγt of aortas（±s，n＝4）***P＜0.001 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Figure 4 Effects of YHF on protein expression of Foxp3 or RORγt of aortas（xˉ±s，n＝3）A:Protein level of Foxp3 and RORγt of aortas were detected by Western blot；B:Protein relative quantitation of Foxp3 and RORγt**P＜0.01，***P＜0.001 vs control group；＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001 vs model group

Figure 5 Effects of YHF on the protein expression of Foxp3 or RORγt of aortas（IHC:200×，±s，n＝3）A:Protein level of Foxp3 and RORγt of aortas were detected by immunohistochemical（IHC）；B:Positive ratio of Foxp3 or RORγt protein in aortas*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs model group

3.6 YHF對體外培養(yǎng) CD4＋T細胞 Foxp3、RORγt mRNA表達的影響

相較于正常組，LPS組 CD4＋T細胞 Foxp3 mRNA表達下降（P＜0.05），RORγt mRNA表達上升（P＜0.05），表明 LPS有利于 RORγt的表達，而不利于 Foxp3的表達。相較于 LPS組，2、4 mg／L YHF水提液上調(diào)Foxp3 mRNA表達（P＜0.05），1、2、4 mg／L YHF水提液下調(diào) RORγt mRNA表達（P＜0.05），且YHF對Foxp3 mRNA表達的影響呈劑量依賴性。結(jié)果表明，YHF可以增加體外培養(yǎng)CD4＋T細胞Foxp3 mRNA表達而降低RORγt mRNA表達（圖6）。

3.7 YHF對體外培養(yǎng) CD4＋T細胞 Foxp3、RORγt蛋白表達的影響

相較于正常組，LPS組CD4＋T細胞Foxp3蛋白表達下調(diào)，RORγt蛋白表上調(diào)。相較于LPS組，YHF上調(diào)Foxp3蛋白表達，同時下調(diào)RORγt蛋白表達。結(jié)果表明，YHF上調(diào)體外CD4＋T細胞中Foxp3蛋白表達而下調(diào)RORγt蛋白表達。

Figure 6 Effects of YHF on mRNA expression of Foxp3 or RORγt of CD4＋T cells treated by lipopoly saccharide（LPS）（xˉ±s，n＝4）*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Figure 7 Effects of YHF on expression of Foxp3 or RORγt protein of CD4＋T cells

4 討 論

AS發(fā)病機制復(fù)雜，脂質(zhì)代謝障礙是其發(fā)病基礎(chǔ)［9］，本研究采用長期高脂飲食造成ApoE-／-小鼠脂質(zhì)代謝紊亂，誘發(fā)AS。高水平的脂質(zhì)可造成LPS易位增加，引發(fā)低強度全身性炎癥反應(yīng)［10］及免疫活化，造成免疫細胞失衡，進一步加快AS進程［11］。脂質(zhì)紊亂、低度炎癥以及免疫平衡破壞都參與AS發(fā)生發(fā)展。

YHF已在臨床上運用多年，對AS療效確切，長期用藥對肝的毒性較辛伐他汀更低［8］。在ApoE-／-小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)YHF可顯著減少AS斑塊形成，有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平，減輕炎癥反應(yīng)，但YHF對免疫的影響尚不明確。大量研究已經(jīng)證實，AS發(fā)展過程中存在明顯的 Treg／Th17失衡［4］，因而本項研究著重探討了YHF對Treg／Th17失衡的影響。

體內(nèi)研究結(jié)果顯示高脂飲食可破壞ApoE-／-小鼠Treg／Th17平衡，表明長期高脂飲食會引發(fā)免疫失衡。Foxp3和RORγt分別是Treg和Th17的特征性轉(zhuǎn)錄因子，分別在維持兩者的穩(wěn)定表達和功能中具有至關(guān)重要的作用［12-13］，其表達變化在一定程度上反映了Treg／Th17的變化。對主動脈Foxp3和RORγt表達的檢測結(jié)果表明，高脂飲食引起了主動脈Foxp3表達的下降和RORγt表達的增加。而在YHF的干預(yù)之下，F(xiàn)oxp3表達增加，RORγt表達下降，Treg／Th17的比例增加，表明YHF確能改善高脂飲食引發(fā)的Treg／Th17失衡狀態(tài)。

在AS的發(fā)展過程中，感染也是一個重要的誘發(fā)因素。在體內(nèi)，腸道細菌失衡會增加腸道通透性，導(dǎo)致循環(huán)LPS增加；外界的結(jié)核分枝桿菌等細菌感染機體的過程中也會釋放LPS。LPS主要通過TLR4信號傳導(dǎo)引起單核-巨噬細胞及樹突狀細胞的炎性反應(yīng)，引發(fā)機體固有免疫應(yīng)答［12，14］。同時，LPS也能以獨立于TLR4信號的機制發(fā)揮作用［15］，影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究表明LPS暴露會引起Th1、Th2、Th17以及Treg的數(shù)量及功能的變化，影響機體免疫平衡［15-16］。因而，本研究在體外用LPS刺激活化的CD4＋T細胞（anti-CD3／anti-CD28刺激），模擬體內(nèi)CD4＋T細胞所處的炎性環(huán)境，觀察YHF的干預(yù)作用。結(jié)果表明，LPS刺激的CD4＋T細胞Foxp3表達減少而RORγt表達增加，表明CD4＋T細胞在LPS炎性刺激下Treg／Th17平衡發(fā)生了改變。YHF干預(yù)后，CD4＋T細胞Foxp3表達增加而RORγt表達減少，表明YHF對CD4＋T細胞遭受LPS炎性刺激后的反應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用。

本研究從炎癥免疫的角度探討了YHF對AS發(fā)病過程的影響，實驗結(jié)果表明，YHF可以在一定程度上對高脂誘導(dǎo)的 ApoE-／-小鼠 Treg／Th17失衡進行糾正，抑制LPS炎性刺激下CD4＋T細胞向Th17的極化。AS發(fā)病是一個復(fù)雜的過程，脂質(zhì)、炎癥以及免疫都積極參與了AS疾病的發(fā)生發(fā)展。中藥復(fù)方Y(jié)HF對AS的治療作用在于其可以發(fā)揮調(diào)脂和抗炎性免疫反應(yīng)的作用，但其具體分子機制還未闡明。