草珊瑚種子離體培養(yǎng)研究初探

付燕?萬新屏

摘要 以草珊瑚種子作為外植體，研究了赤霉素和NaOH浸種、升汞處理時間長短、不同培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對草珊瑚種子離體培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：0.02%赤霉素浸種24 h不僅可以提高草珊瑚種子萌芽率，還可以縮短萌發(fā)時間;采用0.1%升汞處理種子3 min，種子的污染率僅1.17%;草珊瑚種子初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂，萌芽率達(dá)78.87%;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)82.96%。

關(guān)鍵詞 草珊瑚;種子;離體培養(yǎng);赤霉素;植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號：R282.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095–3305（2020）08–0–02

Abstract Seeds were used as explants to study the effects of the immersion of GA3 and NaOH， the duration of mercury-rising treatment， different media and plant growth regulator on the in vitro culture of? Sarcandra glabra.The results showed that immersion 24 hours with 0.02% GA3 could not only improve seed germination rate， but also shorten germination time;The contamination rate of seeds was only 1.17% with 0.1% HgCl2 treatment for 3min;The best culture medium for the primary culture of seed was 1/4 MS +0.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L sucrose + 5g/L agarophyte， the germination rate was 78.87%;The best medium for proliferation was MS + 4.0mg/L 6-BA + 0.5mg/L NAA+30g/L sucrose+5g/L agarophyte， and The induced rate of fascicled shoots reached 82.96%.

Key word Seeds; Sarcandra glabra; In vitro culture; GA3; Plant growth regulator

DOI：10.19383/j.cnki.nyzhyj.2020.08.009

草珊瑚（Sarcandra glabra （Thunb.）Nakai）是金粟蘭科，屬多年生常綠草本，主要分布于中國安徽、浙江、江西、福建、四川、貴州、云南等地。草珊瑚株供藥用，能清熱解毒、祛風(fēng)活血、消腫止痛、抗菌消炎[1]。隨著草珊瑚藥用價值的不斷開發(fā)，目前草珊瑚已逐漸由挖掘野生資源轉(zhuǎn)為人工種植，但種苗繁育技術(shù)一直是限制草珊瑚大面積種植的因子[2]。目前生產(chǎn)中主要采用種子育苗和扦插育苗兩種方式繁育種苗，繁殖系數(shù)較低。通過植物組培快繁技術(shù)，能極大地提高育苗系數(shù)，滿足生產(chǎn)用苗所需。以成熟的草珊瑚種子為外植體，以清水為對照，比較赤霉素和NaOH浸種對種子萌發(fā)效果的影響，同時通過對培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑的篩選，研究草珊瑚離體再生體系，為生產(chǎn)中草珊瑚種苗繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

（1）草珊瑚成熟果實采至天柱縣林下野生草珊瑚植株，采集后去掉果肉，清水沖洗干凈，放陰涼通風(fēng)處備用。

（2）外植體的處理。接種之前，外植體用0.02%的赤霉素溶液浸泡24 h和0.5 mol/L NaOH溶液浸泡處理24 h，以清水為對照，浸泡后除去漂浮種子，流水沖洗10 min，接種到1/4 MS+0.5

mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，比較赤霉素和NaOH浸種對種子萌發(fā)的影響。

在超凈工作臺上，先用75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3～4次，分別用0.1%升汞浸泡3 min、5 min和7 min，浸泡過程中不停振蕩液體，再用無菌水沖洗3～4次。比較0.1%升汞不同處理時長對種子污染和萌發(fā)率的影響。

處理后的種子分別接種到三種初代培養(yǎng)基上：MS+0.5 mg/L 6-BA、1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA、1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA、1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA+

0.05 mg/L NAA。每瓶接種3顆種子，每個處理30瓶。觀察并統(tǒng)計各培養(yǎng)基中外植體誘導(dǎo)分化出芽的情況。

發(fā)芽率（%）=（萌芽種子數(shù)/接種種子總數(shù)）×100%;

污染率（%）=（污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)）×100%;

褐化率（%）=（褐化種子數(shù)/接種種子總數(shù)）×100%。

（3）種子萌芽后，將芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA、MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA、MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA、MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA、MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。每個處理接種30個芽，試驗重復(fù)3次。

（3）培養(yǎng)條件。所有培養(yǎng)基附加30 g/L蔗糖和5 g/L的瓊脂，培養(yǎng)條件為25℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

（5）數(shù)據(jù)分析。試驗數(shù)據(jù)用spss19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用Duncan't法作顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 升汞不同處理時長對種子污染率和萌發(fā)率的影響

用0.1%的升汞處理草珊瑚種子，不同處理時長對種子的萌發(fā)有一定的影響。處理3 min、5 min和7 mim，種子的污染率都較低，各處理間比較沒有顯著差異，發(fā)芽率升汞處理3 min顯著高于5 min和7 min，但種子褐化率隨處理時間延長而顯著增加（表1）。因此，綜合考慮，草珊瑚種子外植體滅菌處理可采用0.1%升汞處理3 min。

2.2 赤霉素和NaOH浸種對草珊瑚種子萌芽效果的影響

經(jīng)過0.02%赤霉素和0.5 mol/L NaOH浸種處理的種子在萌發(fā)時間和萌發(fā)率上都有顯著差異。0.02%赤霉素處理的種子萌發(fā)時間最短，接種后25 d左右開始膨大，然后種子逐漸出現(xiàn)綠色，35 d左右突破種皮，逐漸萌發(fā);0.5 mol/L NaOH處理的種子萌發(fā)稍晚于赤霉素處理的種子，30 d左右膨大，40 d左右種子開始逐漸萌發(fā);清水處理35 d左右開始膨大，逐漸出現(xiàn)綠色，45 d左右突破種皮，逐漸萌發(fā)。接種后60 d統(tǒng)計發(fā)芽率，發(fā)芽率最高的為赤霉素處理的種子，發(fā)芽率≥78.87%，其次為NaOH處理的種子，達(dá)67.67%，清水浸種處理萌發(fā)率最低（表2）。因此，在后期研究中，草珊瑚種子外植體處理程序為：先用0.02%赤霉素溶液浸種處理24 h，然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3～4次，再用0.1%升汞浸泡3 min，接種到初代培養(yǎng)基上。

2.3 培養(yǎng)基成分對草珊瑚種子萌發(fā)的影響

基本培養(yǎng)基對草珊瑚種子的發(fā)芽率和幼苗生長狀況具有顯著影響?；九囵B(yǎng)基為MS時，種子萌芽率最低，苗較矮、節(jié)間短。隨著培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度降低，草珊瑚種子的萌芽率逐漸提高，其中1/4 MS培養(yǎng)基種子萌芽率最高。植物生長調(diào)節(jié)劑需要配合使用6-BA與低濃度NAA，種子萌芽率最高，為78.89%，幼苗生長健壯。單獨(dú)使用6-BA誘導(dǎo)效果不及與NAA配合使用效果理想，且培養(yǎng)基中只添加6-BA時，胚根在生長過程中出現(xiàn)異常膨大，幼苗節(jié)間縮短。通過篩選，草珊瑚種子初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA（表3）。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對草珊瑚組培苗增殖效果的影響

將萌發(fā)后的草珊瑚種苗去掉胚根，分別接種到5種增殖培養(yǎng)基中。草珊瑚增殖比較緩慢，5種培養(yǎng)基中的草珊瑚頂芽均在接種后25 d左右開始萌發(fā)側(cè)芽，40 d左右從基部逐漸萌發(fā)出叢生芽，60 d左右逐漸形成叢生苗。不同濃度的6-BA和NAA配比對草珊瑚叢生芽增殖效果存在顯著差異，隨著6-BA濃度逐漸升高，誘導(dǎo)率也逐漸升高，苗節(jié)間逐漸變長;而NAA濃度相對較高時，芽生長的同時基部萌發(fā)根系或出現(xiàn)愈傷組織，誘導(dǎo)率不理想，其中5號處理MS +4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)效果最好，叢生芽數(shù)量多，苗生長健壯（表4）。

3 討論

草珊瑚為一種廣譜性中藥材，使用范圍廣，隨著開發(fā)利用的不斷擴(kuò)展，需求量急增;而在開發(fā)過程中，很多藥農(nóng)卻忽視了對資源的保護(hù)，在采集時圖方便，往往是連根拔起，致使野生資源遭受毀滅性的破壞，造成原料藥材供應(yīng)緊張。而傳統(tǒng)的播種出苗慢，繁殖系數(shù)低，周期長，存在苗木參差不齊的現(xiàn)象，影響了栽培的成活率[3]。本研究采用種子為外植體進(jìn)行草珊瑚組培育苗，在接種種子前，采用赤霉素浸種24 h處理，不僅可以使種子充分吸水，還可以打破種子的休眠，使種子提早萌發(fā)，提高發(fā)芽率[4]。雖然使用NaOH也能縮短種子萌發(fā)時間，但效果不及赤霉素效果理想。

在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的種類和植物生長調(diào)節(jié)劑都對培養(yǎng)材料的生長有重要影響。在本研究中，由種子作外植體的初代培養(yǎng)中，1/4 MS培養(yǎng)基對種子的萌發(fā)最為有利，而低濃度6-BA和NAA配合使用能顯著提高萌芽率。在增殖培養(yǎng)中，增殖效果最好的是MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖效果好，可促進(jìn)苗生長健壯。本研究還發(fā)現(xiàn)，用草珊瑚種子作外植體，種子萌發(fā)需要的時間比較長，在增殖過程中，需要的增殖周期也較一般草本植物長，這與黎穎菁等[5]的研究結(jié)果一致。因此，需要在后期研究中進(jìn)一步調(diào)整培養(yǎng)基配方，縮短增殖周期，達(dá)到大量增殖的效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 黎穎菁.草珊瑚的組織培養(yǎng)與植株再生研究[D].南寧：廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[2] 朱淑穎，楊帆，姜葉琴，等.草珊瑚的無菌播種和叢生芽誘導(dǎo)研究[J].種子，2016，35（8）：32–36.

[3] 覃文學(xué).林下套種草珊瑚栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（9）：64–65.

[4] 張益鋒，何平，胡世俊，等.草珊瑚種子萌發(fā)特性研究[J].中國中藥雜志，2009，34（22）：2950–2957.

[5] 黎穎菁，藍(lán)祖栽，凌征柱.草珊瑚的組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].食品與藥品，2008，10（1）：32–34.

責(zé)任編輯：黃艷飛