核酸適配體親和柱凈化-高效液相色譜法測定蓮子中黃曲霉毒素B₁

趙穎 王楠 高華龍 郭子軒 陸安祥 郭曉軍 盧靜華 欒云霞

摘?要?以特異性的核酸適配體作為識別元件，制備了黃曲霉毒素B1 （AFB1）的適配體親和柱（AAC），用于AFB1 的特異性識別和富集。對AAC的載樣液中有機溶劑含量、載樣液的體積和淋洗體積等條件進行了優(yōu)化。此AAC吸附AFB1 的柱容量達到（334.6±18.2） ng，且AAC可重復(fù)使用20次。蓮子樣品經(jīng)AAC凈化富集后，用高效液相色譜-光化學(xué)衍生熒光法檢測，外標(biāo)法定量，AFB1 檢出限達到0.05 ng/mL，回收率為91.8%～108.6%。本方法為食品、農(nóng)產(chǎn)品和中藥等復(fù)雜基質(zhì)中痕量毒素的提取富集和分析提供了新的參考，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞?適配體親和柱;黃曲霉毒素B1 ;固相萃取;N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化的瓊脂糖;蓮子

1?引 言

黃曲霉毒素B1 （Aflatoxin B1 ，AFB1）是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級產(chǎn)物[1]，毒性極強，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃分為I類致癌物[2]。AFB1 具有致突變性、致畸性和致癌性[3～5]，可在采摘前、收獲后儲存、運輸和食用等不同階段對農(nóng)產(chǎn)品、食品及中藥材等產(chǎn)生污染[6]，威脅人類健康。很多國家對AFB1 都有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定中藥材（植物藥）中AFB1 的限量標(biāo)準(zhǔn)為2 μg/kg[1]，我國規(guī)定中藥材中AFB1 的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μg/kg[8]。因此，為了及時發(fā)現(xiàn)污染，防止AFB1 進入食物鏈，并盡量減少國際交易中貿(mào)易壁壘帶來的損失，研究人員不斷尋求快速、可靠地定量檢測黃曲霉毒素的方法。

蓮子是水生草本植物蓮的種子，富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，可食藥兩用[7，8]。然而，蓮子極易被黃曲霉毒素污染[9]，特別在中國南方蓮子主產(chǎn)區(qū)，其濕潤的氣候條件適宜AFB1 的產(chǎn)生，對消費者的健康造成極大威脅。因此，有必要對蓮子中AFB1 的污染狀況進行監(jiān)測和評價[10]，建立蓮子中黃曲霉毒素的有效分析方法，而對蓮子樣品中AFB1 進行提取富集是提高其檢測靈敏度的關(guān)鍵。

目前，常用的AFB1 定性與定量檢測方法有高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography，HPLC）[11～14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）[15]、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[16，17]及薄層色譜法（Thin-layer chromatography，TLC）[18，19]等，廣泛用于谷物、豆類、堅果、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和輔助食品中AFB1 的測定[20～23]。免疫親和柱（Immune affinity column，IAC）是檢測AFB1 時廣泛使用的前處理方法，已被我國國標(biāo)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、中國藥典、國際標(biāo)準(zhǔn)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）等收錄。然而，IAC以抗體為識別元件，而抗體生產(chǎn)依賴動物，存在批次差異大、成本高、對溫度、pH值以及鹽濃度依賴性強、不可逆變性等缺點[24，25]，導(dǎo)致IAC存在價格昂貴、難以重復(fù)使用和檢測成本高等問題。適配體是一類親和力高和特異性強的單鏈核苷酸分子，具有可選擇性識別特定靶標(biāo)的能力。作為“化學(xué)抗體”，核酸適配體具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性、易于修飾、可體外制備和合成成本低等天然優(yōu)勢[26]。因此，制備適配體親和柱（Aptamer affinity column，AAC）用于真菌毒素的凈化富集，具有良好的應(yīng)用前景。

目前，以適配體為識別元件的親和柱已被用于血液、啤酒和花生中小分子目標(biāo)物的前處理，如可卡因、赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）等[27，28，23]。然而，用于富集凈化中藥材中AFB1 的AAC還未見報道。本研究以無毒的N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化的瓊脂糖（N-Hydroxy succinimide，NHS-sepharose）替代傳統(tǒng)親和柱中使用的高毒性溴化氰活化的瓊脂糖作為固相載體[23，29，30]，制備了AFB1-AAC。對AFB1-AAC的柱容量、準(zhǔn)確性、重復(fù)性和特異性等性能進行評價，并與AFB1-IAC的凈化效果進行比較。將優(yōu)化后的AAC用于蓮子樣品中AFB1 的凈化富集，并利用高效液相色譜-光化學(xué)衍生熒光檢測法（HPLC-PCD-FCD）進行分析檢測。

2?實驗方法

2.1?儀器與試劑

1260系列高效液相色譜-熒光檢測器（美國安捷倫公司）;0.2 μm針筒式濾膜過濾器（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）;玻璃纖維濾紙（110 mm，1.5 μm，青島普瑞邦生物工程有限公司）;DHM200渦旋振蕩器（寧波洛尚智能科技有限公司）;FE28 pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;GmbH臺式冷凍離心機（德國Sigma離心機有限公司）;光化學(xué)衍生器（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）;固相萃取柱管（1 mL帶凸緣柱管，天津艾杰爾飛諾美公司）;黃曲霉毒素B1 免疫親和柱（康源泰博生物科技有限公司）。

5-氨基修飾的AFB1 適配體（5-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT TCG CCT TCG CTA GGC CCA CA-3）由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。NHS活化的瓊脂糖溶液（4B，90 mol/L）和Tris-HCl （Sigma-Aldrich公司）;AFB1 、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1 （Aflatoxin G1 ，AFG1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）標(biāo)準(zhǔn)溶液（美國Romer公司）;甲醇和乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）。其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。實驗用水為Milli-Q系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水。

反應(yīng)緩沖液（150 mmol/L NaCl，pH 6.0）;封閉緩沖液（150 mmol/L NaCl和0.2% BSA，pH 6.0）;清洗緩沖液（50 mmol/L Tris HCl和150 mmol/L NaCl，pH 6.0）;結(jié)合緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2，pH 7.5），均于4℃保存。AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（5 ng AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品用結(jié)合緩沖液稀釋并定容至30 mL）

HPLC-PCD-FLD分析條件：色譜柱Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司）;進樣量40 μL;柱溫箱為35℃;檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm;為流動相為甲醇-水（55∶45，V/V），以0.8 mL/min流速進行等度洗脫[23]。

2.2?親和吸附劑的制備

通過氨基與NHS共價偶聯(lián)，將適配體固定在NHS活化的瓊脂糖表面。首先，將氨基修飾的適配體溶于反應(yīng)緩沖液，在95℃加熱5 min，室溫下靜置30 min，使適配體形成所需的構(gòu)象。取300 μL NHS活化的瓊脂糖，用1 mL 10% HCl洗滌2次。將適配體加到NHS活化的瓊脂糖孵育2 h，在室溫下振蕩。離心，去除上清液，加入封閉緩沖液，在室溫下振蕩2 h。將懸浮液裝入1 mL 固相萃取柱管中，用5 mL清洗緩沖液清洗，最后用5 mL結(jié)合緩沖液將適配體親和柱活化，于4℃保存。

2.3?AFB1-AAC的操作流程

將AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液加樣至AAC，依次經(jīng)過淋洗和洗脫，用HPLC檢測洗脫液中AFB1 ，計算回收率，以篩選AAC的富集凈化的最佳條件。首先，用5 mL結(jié)合緩沖液將AAC活化;然后，將30 mL AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液上樣至AAC中，以1 mL結(jié)合緩沖液淋洗，1 mL甲醇洗脫。洗脫液于40℃氮吹至近干，用1 mL 液相色譜流動相復(fù)溶，過0.2 μm濾膜，用HPLC-PCD-FLD檢測。

AFB1-AAC的再生：使用前，AAC用5 mL結(jié)合緩沖液活化，經(jīng)過富集凈化過程后，用5 mL結(jié)合緩沖液活化，進行再生，4℃保存，以備下一次使用。

2.4?樣品處理

準(zhǔn)確稱取5 g蓮子樣品（精確至0.01 g）和1 g NaCl，加入25 mL甲醇-水（70∶30，V/V）進行提取，使用渦旋振蕩器，以2500 r/min振蕩20 min后，10000 r/min離心10 min。每管中取5 mL上清液，稀釋至50 mL，用玻璃纖維濾紙過濾，取續(xù)濾液，備用。以5 mL結(jié)合緩沖液活化AAC后，準(zhǔn)確移取續(xù)濾液30 mL上樣至AAC，1 mL結(jié)合緩沖液淋洗，將2～3 mL空氣通過AAC，1 mL甲醇洗脫，收集的洗脫液在40℃氮吹至近干，用1 mL液相流動相復(fù)溶，過0.2 μm濾膜，轉(zhuǎn)入進樣瓶后，用HPLC-PCD-FLD檢測。

2.5?AFB1-AAC和AFB1-IAC的比較

蓮子加標(biāo)樣品（0.5、5和50 μg/kg）分別通過AFB1-AAC和AFB1 ?IAC進行凈化和富集。根據(jù)AFB1-IAC的使用說明，取10 mL上清液，用20 mL水稀釋后，用玻璃纖維濾紙過濾。將15 mL稀釋液上樣至IAC，10 mL結(jié)合緩沖液淋洗，通入2～3 mL空氣，1 mL甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)40℃氮吹至近干，用1 mL液相流動相復(fù)溶，過0.2 μm膜。最后，分別用HPLC-PCD-FLD檢測，計算回收率，比較IAC和AAC對AFB1 的識別與捕獲能力。

3?結(jié)果與討論

3.1?AFB1-AAC的富集原理

將氨基修飾的AFB1 適配體共價偶聯(lián)至NHS活化的瓊脂糖上，制備AAC[31]。蓮子樣品經(jīng)過提取、過濾、稀釋后，過柱。AFB1 與適配體特異性結(jié)合，未被結(jié)合的干擾物質(zhì)被淋洗出來，flow of AFB1-apatmer affinity column （AAC）最后用甲醇洗脫，洗脫液用HPLC-PCD-FLD檢測，AAC凈化的步驟如圖1所示，包括親和柱的活化、樣品的載入（載樣過程）、干擾物的淋洗和靶標(biāo)的洗脫。

3.2?AFB1-AAC應(yīng)用條件的優(yōu)化

載樣中有機溶劑濃度影響適配體結(jié)合活性，而AFB1 通常是用有機溶劑從樣品中提取的，如本研究采用甲醇-水（70∶30，V/V），高濃度的甲醇會破壞適配體的結(jié)構(gòu)。因此，需考察載樣過程中適配體親和柱對甲醇的最大耐受度。5 ng AFB1用含有不同濃度的甲醇（1%、5%、10%、25%、40%、55%和70%（V/V））的結(jié)合緩沖液稀釋到30 mL，分別全部載樣到適配體親和柱中，用結(jié)合緩沖液淋洗，1 mL甲醇洗脫。由圖2可見，隨著甲醇濃度增加，AFB1 的回收率逐漸下降。載樣液中甲醇濃度小于10%時，回收率接近100%，這與本研究組之前的研究結(jié)果一致[12，23]，表明甲醇濃度應(yīng)控制在10%以下。因此，本研究采用10倍稀釋法稀釋提取液，以降低有機試劑的濃度和基質(zhì)效應(yīng)。

進一步考察AAC捕獲AFB1 的最大載樣體積。將AFB1 （5 ng）標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用結(jié)合緩沖液稀釋至1、 2、 5、 10、 20、 30、 50和65 mL[12，23]。，將稀釋后的溶液分別上樣到AAC中，以相同的淋洗和洗脫步驟處理，結(jié)果如圖3A所示，當(dāng)載樣體積大于30 mL時，回收率低于70%。因此，在實際樣品分析中，選擇載樣體積為30 mL，為文獻[23]報道的AAC載樣體積的6倍。在本課題組之前的報道[12]中，磁珠需在液相體系中進行實驗，為開放體系;而本研究采用的AAC是在固相體系中進行凈化富集，屬于封閉體系，因此，AAC更適合富集純化毒性靶標(biāo)。另外，本研究的偶聯(lián)方式與文獻[12，23]有所不同。鏈霉親和素和生物素非共價偶聯(lián)的方式，存在載樣體積小、不可重復(fù)使用等缺點[12];溴化氫活化的瓊脂糖和氨基修飾的適配體的偶聯(lián)反應(yīng)需過夜反應(yīng)，所需實驗時間較長[23];而本研究中適配體和固相載體的偶聯(lián)時間僅需2 h。對于痕量AFB1 的檢測，載樣體積的增加使更多的AFB1 被適配體識別捕獲，經(jīng)AAC富集凈化后的洗脫液中目標(biāo)物含量更高，有利于提高HPLC-PCD-FLD的檢測靈敏度。

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