特異性檢測(cè)珍珠龍膽石斑魚(yú)虹彩病毒病的核酸適配體的篩選與鑒定

余慶 劉明珠 肖賀賀 易弋 程昊 Putra Dedi-Fazriansyah 黎思巧 李鵬飛

摘?要?石斑魚(yú)虹彩病毒是一種核質(zhì)DNA病毒，不僅給海水養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅全球生物多樣性。為了進(jìn)一步闡明石斑魚(yú)虹彩病毒侵染致病的分子機(jī)理，同時(shí)為石斑魚(yú)虹彩病毒病的預(yù)防、診斷和治療提供新的理論依據(jù)，本研究以珍珠龍膽石斑魚(yú)虹彩病毒（SGIV-Gx）感染的宿主細(xì)胞為靶標(biāo)，采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選獲得4條核酸適配體（LYGV1、 LYGV2、 LYGV3、 LYGV4），并對(duì)核酸適配體的性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析研究。各條核酸適配體識(shí)別SGIV-Gx病毒感染的宿主細(xì)胞具有高特異性和高親和性，篩選的核酸適配體無(wú)毒副作用，而且核酸適配體LYGV3具有一定的抗病毒效果。對(duì)核酸適配體的靶標(biāo)性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，核酸適配體（LYGV1、 LYGV2、 LYGV3、 LYGV4）的靶標(biāo)可能是細(xì)胞膜蛋白或膜蛋白相關(guān)成分。其中，核酸適配體LYGV1的靶位點(diǎn)在SGIV-Gx病毒感染細(xì)胞2 h后出現(xiàn)在宿主細(xì)胞表面，核酸適配體LYGV2、LYGV3和LYGV4的靶位點(diǎn)的出現(xiàn)時(shí)間分別為病毒感染細(xì)胞后的4、8和6 h。

關(guān)鍵詞?石斑魚(yú)虹彩病毒;指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);核酸適配體;特異性;抗病毒;靶蛋白

1?引 言

石斑魚(yú)肉質(zhì)細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，為大宗名貴海水養(yǎng)殖魚(yú)類，目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖年產(chǎn)量已達(dá)15萬(wàn)噸以上，直接產(chǎn)值超過(guò)百億元，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高[1，2]。然而，隨著石斑魚(yú)養(yǎng)殖密度增加、養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，進(jìn)而導(dǎo)致了魚(yú)類疫病頻繁暴發(fā)，經(jīng)濟(jì)損失巨大[3]。其中，石斑魚(yú)虹彩病毒危害嚴(yán)重的石斑魚(yú)疫病病原，其所導(dǎo)致的魚(yú)病致死率極高[4]。目前，研究者已對(duì)石斑魚(yú)虹彩病毒開(kāi)展了系統(tǒng)研究，包括石斑魚(yú)虹彩病毒的流行病學(xué)調(diào)查、病原分離鑒定、石斑魚(yú)細(xì)胞系構(gòu)建、病毒粒子的超微結(jié)構(gòu)觀察、檢測(cè)診斷技術(shù)開(kāi)發(fā)等，在一定程度上揭示了石斑魚(yú)虹彩病毒的侵染致病機(jī)理[5～7]。在目前高密度、集約化的養(yǎng)殖環(huán)境下，石斑魚(yú)虹彩病毒通常表現(xiàn)為暴發(fā)式感染，會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致人工養(yǎng)殖石斑魚(yú)大批死亡，因此，必須著力研發(fā)能夠快速、便捷檢測(cè)石斑魚(yú)虹彩病毒病的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的及時(shí)診斷，保障養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。Qin等[8]制備了虹彩病毒SGIV的高特異性抗體，研發(fā)出可以特異性檢測(cè)石斑魚(yú)虹彩病毒感染的流式檢測(cè)技術(shù)。

核酸適配體是利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在體外經(jīng)過(guò)多輪嚴(yán)格篩選得到的高特異性識(shí)別靶物質(zhì)的單鏈寡核苷酸。核酸適配體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)溫度等外界環(huán)境的耐受性高，具有易于化學(xué)合成和化學(xué)修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)[9，10]，廣泛應(yīng)用于病原或疾病診斷治療等生命科學(xué)領(lǐng)域[11～14]?；诤怂徇m配體能夠識(shí)別病原微生物或病變細(xì)胞的高特異性高親和性等特性，核酸適配體被用于生物傳感器的構(gòu)建，通過(guò)信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物或疾病的精確檢測(cè)診斷。Duan等[15]利用高特異性識(shí)別食源性致病菌的核酸適配體，結(jié)合上轉(zhuǎn)換熒光納米標(biāo)記技術(shù)和免標(biāo)記傳感器等構(gòu)建了一系列靈敏、便捷的檢測(cè)新方法，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品中目標(biāo)致病菌的精確檢測(cè)。Zhou等[16]利用特異性識(shí)別石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒RGNNV衣殼蛋白CP的核酸適配體A10，開(kāi)發(fā)了用于RGNNV精確快速檢測(cè)的Sandwich ELASA方法，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)對(duì)病原的快速檢測(cè)。此外，核酸適配體能夠高特異性地結(jié)合在病原的特定部位，發(fā)揮功能阻斷劑的作用，抑制病原的感染。Gao等[17]篩選了特異性結(jié)合Hepatitis C病毒NS2蛋白和包膜蛋白的ssDNA核酸適配體，對(duì)相關(guān)核酸適配體的抗病毒效果分析后發(fā)現(xiàn)，它們可有效抑制Hepatitis C病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和裝配。綜上，核酸適配體在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中具有重要的理論意義、實(shí)際價(jià)值和應(yīng)用前景。

本研究以珍珠龍膽石斑魚(yú)虹彩病毒（SGIV-Gx）感染的石斑魚(yú)脾細(xì)胞為靶標(biāo)，采用SELEX技術(shù)篩選獲得了可高特異性、高親和性識(shí)別SGIV-Gx感染細(xì)胞的核酸適配體，并對(duì)核酸適配體的性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，包括核酸適配體的特異性、親和性、抗病毒活性、特異性主動(dòng)，以及內(nèi)吞能力和靶位點(diǎn)的性質(zhì)等。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Nikon C2激光共聚焦顯微鏡、TS2倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）;FACSAria II流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）;Multiskan Ascent多功能酶標(biāo)儀、Nano Drop one超微量分光光度計(jì);Mastercycler nexus gradient PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）;qTOWER3G touch熒光定量PCR儀（德國(guó)Analytikjena公司）;AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）;Centrifuge 5417R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）;DK-8D水浴鍋（博訊公司）。

珍珠龍膽石斑魚(yú)虹彩病毒廣西株（Grouper iridovirus guangxi strain，SGIV-Gx）、中華鱉虹彩病毒（Soft shell turtle iridovirus，STIV）、石斑魚(yú)脾細(xì)胞（Grouper spleen cell，GS）和胖頭鯉細(xì)胞（Fathead minnow cell，F(xiàn)HM）保存于本實(shí)驗(yàn)室[18，19];細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿、波底皿、細(xì)胞6孔板和細(xì)胞12孔板（美國(guó)Corning公司）;胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)GIBCO公司）;鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠（美國(guó)Thermo公司）;PCR純化回收試劑盒、膠回收試劑盒、DL2000 Marker、DL50 bp Marker（日本TakaRa公司）。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）： 2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L Na2HPO4，137 mmol/L NaCl，pH 7.2。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物的設(shè)計(jì)構(gòu)建?用于核酸適配體篩選的隨機(jī)起始單鏈ssDNA文庫(kù)、引物和核酸適配體均由上海生工公司合成。隨機(jī)起始單鏈ssDNA文庫(kù)由中間50 bp的隨機(jī)核苷酸序列（N50）和兩端的固定核苷酸序列構(gòu)成（5-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-N50-CGAAGGACGCAGAGAAGTCTC-3）。5端引物序列為5-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3;3端引物序列為5-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3。其中，5端引物有兩種，分別標(biāo)記羥基熒光素（6-Carboxy-fluorescein labeled forward primer，F(xiàn)AM-FP）和無(wú)熒光標(biāo)簽的普通引物（FP）;3端引物標(biāo)記生物素（Biotin labeled reverse primer，biotin-RP）。

2.2.2?SGIV-Gx病毒感染細(xì)胞（靶標(biāo)細(xì)胞）的準(zhǔn)備與處理?將石斑魚(yú)脾細(xì)胞（GS）接入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，瓶底基本鋪滿細(xì)胞后，細(xì)胞中接入20 μL SGIV-Gx（107 TCID50/mL）（TCID50（Tissue culture infective dose）是指病毒能使50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變（Cytopathic effect，CPE）的最小量），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，備用。

2.2.3?SELEX技術(shù)篩選流程?首輪篩選流程如下所述：將10 nmol隨機(jī)起始單鏈DNA文庫(kù)溶解在500 μL PBS緩沖液中，92℃高溫變性8 min，迅速插入冰中，靜置15 min。起始文庫(kù)與靶標(biāo)細(xì)胞在4℃孵育結(jié)合40 min后，離心，移除上清液，并且將靶標(biāo)細(xì)胞用PBS緩沖液清洗。收集靶標(biāo)細(xì)胞，在92℃孵育處理5 min，結(jié)合的單鏈DNA從靶細(xì)胞上解離，1000 r/min離心5 min，收集上清液中的單鏈DNA，將其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4℃ 2 min，94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，20輪循環(huán);72℃ 5 min，獲得雙鏈dsDNA。

利用“鏈霉親和素-生物素”結(jié)合系統(tǒng)分離得到單鏈核酸文庫(kù)，用于次輪篩選。將100 μL包被有鏈霉親和素的磁珠與PCR擴(kuò)增所得的dsDNA室溫孵育30 min，利用dsDNA中反向鏈上的生物素與磁珠上鏈霉親和素的親和作用，使dsDNA結(jié)合到磁珠上;磁性分離，將磁珠用PBS緩沖液清洗2次后，加入200 μL 200 mmol/L NaOH，室溫孵育15 min，利用堿變性的方法將dsDNA的雙鏈分離，正向核酸單鏈游離在上清液中，利用磁性分離器分離磁珠并收集上清液，用HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值。將上清液中正向單鏈核酸用PCR純化回收試劑盒純化回收，收集單鏈核酸文庫(kù)用于次輪篩選。為了提高后續(xù)篩選中核酸單鏈識(shí)別靶細(xì)胞的特異性和親和力，在隨后的篩選過(guò)程中逐步縮短核酸單鏈文庫(kù)與靶標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合時(shí)間，同時(shí)減少核酸單鏈和靶標(biāo)細(xì)胞的使用量，增加PBS緩沖液清洗靶標(biāo)細(xì)胞的次數(shù)。

2.2.4?陰性篩選?為了提高篩選效率和成功率，在第3輪及第3輪以后篩選中，進(jìn)行了陰性篩選，包括“陰性前篩選”和“陰性后篩選”?！瓣幮郧昂Y選”是在每輪正式篩選前，即ssDNA單鏈文庫(kù)與靶標(biāo)細(xì)胞孵育結(jié)合前，先將ssDNA單鏈文庫(kù)與正常GS細(xì)胞在4℃孵育1 h，離心，上清液即為經(jīng)過(guò)“陰性前篩選”的單鏈核酸文庫(kù)，將上清液與靶標(biāo)細(xì)胞孵育結(jié)合?！瓣幮院蠛Y選”是指每輪正式篩選后，收集靶標(biāo)細(xì)胞上結(jié)合的ssDNA單鏈文庫(kù)，然后將此文庫(kù)與正常GS細(xì)胞在4℃孵育1 h，1000 r/min離心5 min，上清液即為經(jīng)過(guò)“陰性后篩選”的單鏈核酸文庫(kù)，以此文庫(kù)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2.5?核酸適配體序列的確定?將最終得到的單鏈核酸文庫(kù)經(jīng)PCR擴(kuò)增為dsDNA，切膠回收后，連接到pUC-T 載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，菌液均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基（氨芐抗性），在28℃生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆由上海生工公司測(cè)序，得到核酸適配體序列。使用MFOLD軟件預(yù)測(cè)核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.2.6?激光共聚焦顯微鏡分析核酸適配體識(shí)別靶標(biāo)細(xì)胞的特異性?將GS細(xì)胞接入玻底皿中，28℃培養(yǎng)18 h。將20 μL SGIV-Gx病毒（107 TCID50/mL）接入細(xì)胞中，對(duì)照組共兩組，分別為不接入SGIV-Gx病毒的正常GS細(xì)胞和接入STIV病毒的FHM細(xì)胞。各組細(xì)胞在28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在光鏡下觀察細(xì)胞的病變情況。FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體（500 nmol/L）經(jīng)過(guò)92℃恒溫水浴、冰浴處理后加入細(xì)胞中，4℃孵育40 min后，移除上清液，并用細(xì)胞培養(yǎng)基清洗，略干燥后，用抗熒光淬滅劑封片，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察。

2.2.7?流式細(xì)胞術(shù)定量分析核酸適配體識(shí)別靶標(biāo)細(xì)胞的特異性?GS細(xì)胞接入24孔板中，28℃培養(yǎng)18 h。將20 μL SGIV-Gx病毒（107 TCID50/mL）接入24孔板的細(xì)胞中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對(duì)照組共兩組，分別為不接入SGIV-Gx病毒的正常GS細(xì)胞和接入STIV病毒的FHM細(xì)胞。在光鏡下觀察細(xì)胞的病變情況，然后收集24孔板中的細(xì)胞。FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體（500 nmol/L）經(jīng)過(guò)92℃恒溫水浴、冰浴的變復(fù)性處理，與病毒感染的細(xì)胞于4℃結(jié)合40 min。離心清洗3次，用500 μL PBS緩沖液重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)反應(yīng)均重復(fù)3次。

2.2.8?核酸適配體的細(xì)胞毒性分析?在96孔板中接種GS細(xì)胞，28℃培養(yǎng)18 h。將核酸適配體在細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋至2000 和1000 nmol/L，與細(xì)胞于28℃孵育48 h。在各孔中加入20 μL CCK-8溶液，室溫孵育4 h后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光值，以檢測(cè)細(xì)胞活性，以未與核酸適配體孵育的正常GS細(xì)胞作為對(duì)照組，做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將測(cè)得的吸光值代入公式（1），計(jì)算各組細(xì)胞的存活率（Survival rate，SR）[20，21]：

2.2.9?核酸適配體的親和常數(shù)計(jì)算?FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體經(jīng)過(guò)92℃恒溫水浴、冰浴的變復(fù)性處理后，稀釋至不同濃度（0～2000 nmol/L），與SGIV-Gx病毒感染的GS細(xì)胞在4℃避光結(jié)合40 min。離心清洗3次，重懸在500 μL PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體與正常細(xì)胞的結(jié)合作為對(duì)照。不同濃度核酸適配體與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度平均值減去相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞結(jié)合平均值，按公式（2）計(jì)算：

其中，Bmax表示核酸適配體與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的最大平均熒光強(qiáng)度值。Y表示在核酸適配體在相應(yīng)濃度下與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度值;X表示核酸適配體在相應(yīng)濃度;Kd表示核酸適配體的親和常數(shù)，采用Sigmaplot軟件進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)反應(yīng)均做3個(gè)重復(fù)。

2.2.10?核酸適配體的靶標(biāo)性質(zhì)分析?將SGIV-Gx病毒感染的GS細(xì)胞用胰酶消化處理2 min，將細(xì)胞離心清洗3次，與FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體（500 nmol/L）在4℃孵育40 min。離心清洗3次，然后重懸在500 μL PBS中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)照組中，F(xiàn)AM熒光標(biāo)記的核酸適配體與SGIV-Gx病毒感染的GS細(xì)胞孵育結(jié)合。每個(gè)反應(yīng)均做3個(gè)重復(fù)。

2.2.11?核酸適配體的靶標(biāo)出現(xiàn)在SGIV-Gx病毒感染的GS細(xì)胞表面的時(shí)間?GS細(xì)胞在24孔板中28℃培養(yǎng)18 h，將20 μL SGIV-Gx（107 TCID50/mL）病毒接入24孔板的細(xì)胞中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)。分別在病毒感染的第2、4、6、8、10和12 h觀察細(xì)胞的病變情況，收集細(xì)胞與FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體（500 nmol/L） 在4℃避光結(jié)合40 min。離心清洗3次，重懸在500 μL PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)照組將FAM熒光標(biāo)記的核酸適配體（500 nmol/L）與正常GS細(xì)胞孵育結(jié)合。每個(gè)反應(yīng)均做3個(gè)重復(fù)。

2.2.12?核酸適配體的抗病毒活性分析?核酸適配體對(duì)SGIV-Gx病毒的抑制效果分析實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[21，22]方法。GS細(xì)胞在24孔板于28℃培養(yǎng)18 h，然后將核酸適配體（500 nmol/L）與1 μL SGIV-Gx（107 TCID50/mL）病毒冰浴結(jié)合后接種入細(xì)胞。僅接入病毒、不接入核酸適配體的細(xì)胞作為對(duì)照組。然后分別在12和24 h收集24孔板中的細(xì)胞和培養(yǎng)基，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得cDNA，以cDNA為模板，β-actin基因作為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)石斑魚(yú)虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因和病毒囊膜蛋白VP19基因的表達(dá)量，每個(gè)反應(yīng)均做3個(gè)重復(fù)。結(jié)果用于分析核酸適配體的抑制SGIV-Gx病毒的抗病毒活性。RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)MCP基因和囊膜蛋白VP19基因所使用的引物見(jiàn)表1。

3?結(jié)果與討論

3.1?SELEX技術(shù)篩選SGIV-Gx病毒感染細(xì)胞（靶標(biāo)細(xì)胞）的特異性核酸適配體

細(xì)胞被病毒感染時(shí)，細(xì)胞膜成分將發(fā)生修飾或改變，這些修飾和改變是識(shí)別病毒感染細(xì)胞和病毒感染治療的重要生物標(biāo)志物[23]。本研究以SGIV-Gx病毒感染的石斑魚(yú)脾細(xì)胞（GS）為靶標(biāo)細(xì)胞，運(yùn)用SELEX技術(shù)進(jìn)行靶標(biāo)細(xì)胞的核酸適配體篩選。以FAM熒光標(biāo)記的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)（500 nmol/L）與靶標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合為對(duì)照，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著篩選輪數(shù)增加，單鏈核酸文庫(kù)的特異性逐步升高，經(jīng)過(guò)12輪篩選，第11輪的單鏈核酸文庫(kù)對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞的特異性識(shí)別能力最強(qiáng)（圖1）。因此對(duì)第11輪的篩選文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序，共得到4條核酸適配體LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4（表2）。已報(bào)道了一些針對(duì)病毒性或細(xì)菌性病的特異性核酸適配體[13，20～30]等。目前，核酸適配體的技術(shù)難點(diǎn)仍然主要在于篩選流程，不同物質(zhì)作為靶標(biāo)進(jìn)行核酸適配體的篩選，所需的SELEX技術(shù)篩選輪數(shù)和參數(shù)不同，SELEX技術(shù)仍未能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，因此篩選出高特異性核酸適配體的難度較高。例如，Liang等[22]以狂犬病病毒感染細(xì)胞為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)35輪的篩選才最終得到高特異性的核酸適配體T14和 F34;而Zhou等[20]僅經(jīng)過(guò)11輪的篩選就獲得了特異性識(shí)別赤點(diǎn)神經(jīng)壞死癥病毒的核酸適配體。本研究為了提高篩選效率，參考文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)陰性篩選流程進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，分別設(shè)置了“陰性前篩選”和“陰性后篩選”，因此，經(jīng)過(guò)11輪篩選就成功獲得了高特異性識(shí)別SGIV-Gx病毒感染的石斑魚(yú)脾細(xì)胞的核酸適配體庫(kù)。

3.2?核酸適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

利用MFOLD對(duì)篩選獲得的核酸適配體LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4的二級(jí)結(jié)構(gòu)和吉布斯自由能（ΔG）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。4條核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，它們均會(huì)形成獨(dú)特復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中LYGV3的吉普斯自由能（ΔG）最低，為26.80 kJ/mol，提示其結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定（圖2）。在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，核酸適配體通過(guò)氫鍵、堿基堆積和范德華力等自折疊形成更復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，核酸適配體可以通過(guò)自適應(yīng)變化、空間構(gòu)型互補(bǔ)，特異性識(shí)別和結(jié)合到靶物質(zhì)的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。因此這些二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成了核酸適配體與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[11，31]。據(jù)報(bào)道，核酸適配體的部分核苷酸序列或結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄涮禺愋允欠潜匦璧?，在未?lái)的研究中，有必要對(duì)核酸適配體的高特異性識(shí)別靶物質(zhì)的核酸序列或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析鑒定，這對(duì)于優(yōu)化核酸適配體結(jié)構(gòu)、制備具有更高親和力和特異性的核酸適配體用于相關(guān)功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有重要意義[31]。

3.3?適配體的特異性分析

可用于核酸適配體篩選的靶標(biāo)種類廣泛，包括金屬離子、無(wú)機(jī)和有機(jī)小分子、肽和蛋白質(zhì)等單一靶標(biāo)分子，以及病毒、寄生蟲(chóng)、細(xì)胞、組織等復(fù)雜生物靶標(biāo)體系[32]。但是，針對(duì)細(xì)胞復(fù)雜靶標(biāo)體系的篩選，最終獲得的特異性核酸適配體庫(kù)可能會(huì)更復(fù)雜，這不僅取決于復(fù)雜靶標(biāo)體系中目標(biāo)分子的數(shù)量和豐度，還取決于核酸適配體自身針對(duì)不同靶標(biāo)分子的特異性。對(duì)本研究篩選獲得的核酸適配體的特異性進(jìn)行了系統(tǒng)分析（圖3）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組SGIV-Gx病毒感染的細(xì)胞熒光值高，對(duì)照組細(xì)胞的熒光值較低，而且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的數(shù)據(jù)差異極顯著，說(shuō)明核酸適配體LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4識(shí)別SGIV-Gx病毒感染的細(xì)胞具有高特異性（圖3A）。

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