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    賒店老酒大曲中耐高溫霉菌的篩選與產(chǎn)酶條件優(yōu)化

    2020-05-11 12:30:11劉延波張麗婷趙志軍王賢孫西玉潘春梅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:糖化酶耐高溫大曲

    劉延波 張麗婷 趙志軍 王賢 孫西玉 潘春梅

    摘要: 從賒店老酒大曲中分離篩選得到1株在60 ℃仍能生長(zhǎng)的霉菌,將其命名為B8。對(duì)該菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和種屬鑒定,確定其為根霉菌(Rhizopus),最適生長(zhǎng)溫度為45 ℃。以該菌株為出發(fā)菌株,通過(guò)單因素試驗(yàn)測(cè)定其糖化酶活力和液化酶活力,結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化其培養(yǎng)條件,測(cè)得其糖化酶活力在料水比為5 g ∶3 mL、氮源添加量為0.4%、培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)最高,經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證酶活力達(dá)到162.38 U/g,與預(yù)測(cè)值基本接近;液化酶活力在料水比為5 g ∶3 mL、氮源添加量為0.4%、培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)最高,經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證酶活力達(dá)到41.57 U/g,與預(yù)測(cè)值基本接近。

    關(guān)鍵詞: 賒店老酒;大曲;霉菌;耐高溫;液化酶;糖化酶;響應(yīng)面回歸方程;產(chǎn)酶條件

    中圖分類(lèi)號(hào):S182;TS262.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)05-0268-08

    白酒的產(chǎn)量與品質(zhì)主要取決于大曲中微生物的協(xié)同參與作用[1-2],而在大曲的真菌群落中,霉菌是很重要的一類(lèi)微生物[3]。一方面,霉菌為其他微生物提供生長(zhǎng)因子;另一方面,霉菌產(chǎn)生的淀粉酶對(duì)白酒釀造有至關(guān)重要的作用[4-5]。淀粉酶主要包括液化酶和糖化酶,對(duì)淀粉的水解能力極強(qiáng)[6-8]。

    在制曲過(guò)程中,中高溫大曲溫度達(dá)到60 ℃以上時(shí),將大量耐熱性差的微生物淘汰,相當(dāng)于一個(gè)富集嗜熱菌的過(guò)程[9]。而嗜熱功能霉菌對(duì)白酒的風(fēng)味起著重要的作用,具有重要的研究?jī)r(jià)值[10]。目前關(guān)于白酒大曲中耐高溫細(xì)菌的研究較多,如葛媛媛等從高溫大曲中篩選出85株可以耐受55 ℃溫度的嗜熱細(xì)菌[11],周瑞平等從偏高溫大曲中篩選出可耐受72 ℃高溫的嗜熱細(xì)菌[12];而對(duì)濃香型白酒中高溫大曲中耐高溫霉菌的研究較少。因此,本研究以賒店老酒的中高溫大曲為試驗(yàn)材料篩選得到耐高溫霉菌,并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究,以期揭示制曲過(guò)程和釀酒規(guī)律,為后期運(yùn)用優(yōu)勢(shì)菌優(yōu)化白酒生產(chǎn)工藝、提高白酒出酒率提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    1.1.1 材料和試劑 試驗(yàn)材料:賒店老酒股份有限公司的中高溫大曲。

    培養(yǎng)基:PDA(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基);孟加拉紅培養(yǎng)基;麩皮培養(yǎng)基。

    0.2 mol/L醋酸緩沖液:稱(chēng)取乙酸鈉13.4 g,以蒸餾水溶解,加入冰醋酸5.2 mL,定容于1 000 mL容量瓶中,搖勻,pH 值4.6。

    2%可溶性淀粉:稱(chēng)取2 g淀粉,加入少量煮沸后的蒸餾水調(diào)成糊狀,再加入約50 mL煮沸的蒸餾水,攪拌均勻,再煮沸1 min,冷卻,加入10 mL 0.2 mol/L 乙酸緩沖液,于容量瓶中定容至100 mL。

    DNS試劑:稱(chēng)取3,5-二硝基水楊酸10 g,置于約600 mL水中,逐漸加入NaOH 10 g,在50 ℃水浴鍋中攪拌溶解,再依次加入酒石酸鉀鈉200 g、苯酚2 g、無(wú)水亞硫酸鈉5 g,待全部溶解并澄清后,冷卻至室溫,用水定容至1 000 mL,過(guò)濾。貯存于棕色試劑瓶中,于暗處放置7 d后使用。

    工作碘液:500 mg I2和5 g KI溶于100 mL水中,即為貯藏碘液,取1 mL貯藏碘液稀釋至100 mL即為工作碘液。

    1.1.2 儀器和設(shè)備 SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司);水浴鍋(山東方科儀器有限公司);振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司);GH-500ASB型隔水式培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司);LDZX-50KBS型高壓滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 霉菌的分離純化

    稱(chēng)取10 g大曲研磨,在無(wú)菌條件下加入到90 mL無(wú)菌水中,150 r/min充分振蕩30 min。取上清液1 mL即為10-1稀釋度,加入9 mL的無(wú)菌水中制成10-2稀釋度,重復(fù)此步驟,直到稀釋度為10-7。吸取各稀釋度100 μL涂布于已經(jīng)凝固的PDA培養(yǎng)基上,1個(gè)梯度做3個(gè)平行。30 ℃條件下培養(yǎng)3~5 d,完成初步分離。將得到的菌株用平板劃線法進(jìn)行純化,純化2~3次即可得到純菌落。鏡檢[13],于孟加拉紅斜面培養(yǎng)基試管中 4 ℃ 保藏。

    1.2.2 耐高溫霉菌的篩選

    將保藏的霉菌分別接種到平板上,置于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后,緩慢將培養(yǎng)溫度升高并將菌株繼續(xù)轉(zhuǎn)接,分別于40、45、50、55、57、60 ℃溫度下培養(yǎng)3~5 d,直到獲得最耐高溫的菌株[14]。每株菌做3個(gè)平行。

    1.2.3 菌株18S rDNA分析[15]

    用Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,真菌核糖體rRNA區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    PCR反應(yīng)試劑:SanTaq PCR Mix預(yù)混液、ddH2O、marker,生工生物工程(上海)股份有限公司。真菌核糖體擴(kuò)增引物為通用引物對(duì)ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。反應(yīng)體系為 50 μL(SanTaq PCR Mix預(yù)混液25 μL,引物各 2 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL)。

    PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 6 min;94 ℃ 45 s,53 ℃ 45 s,72 ℃ 120 s,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性,PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,然后在NCBI上通過(guò)BLAST程序進(jìn)行同源性比較與分析。采用MEGA 6.0軟件作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    1.2.4 酶活的測(cè)定方法

    1.2.4.1 液化酶活力:YOO改良法[16]

    酶活力定義:于40 ℃下,5 min內(nèi)水解1 mg淀粉(0.5%淀粉)的酶量為1個(gè)活力單位,以“U/g”表示。

    1.2.4.2 糖化酶活力:DNS法[17]

    葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

    酶活力定義:于40 ℃下、pH 值為4.6的條件下,每1 h水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖作為1個(gè)酶活力單位,以“U/g”表示。

    1.2.5 耐高溫霉菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

    1.2.5.1 不同料水比對(duì)菌株酶活的影響

    以麩皮和不同水分混合制成麩曲,為菌株生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ),菌株在不同料水比麩曲中培養(yǎng)其產(chǎn)酶活力也不同。選取分離得到的耐高溫菌株,設(shè)置料水比為 5 g ∶1 mL、5 g ∶2 mL、5 g ∶3 mL、5 g ∶4 mL、5 g ∶5 mL,將料水混合均勻[18],配制好麩皮培養(yǎng)基以相同的量分裝到三角瓶中,0.1 MPa滅菌20 min,冷卻后接種,每隔12 h進(jìn)行1次搖瓶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。干燥10 h后以pH值為7.5的磷酸緩沖溶液浸提1 h配制成粗酶液[19],對(duì)其進(jìn)行液化酶活力和糖化酶活力的測(cè)定。

    1.2.5.2 不同氮源添加量對(duì)菌株酶活力的影響

    在麩曲中加入(NH4)2SO4不僅為菌株生長(zhǎng)提供氮源,且對(duì)菌株生長(zhǎng)環(huán)境中pH值也有一定的影響。因此本試驗(yàn)選?。∟H4)2SO4作為氮源,分別以0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%進(jìn)行試驗(yàn)[20],以最適料水比配制麩皮培養(yǎng)基,并以相同的量分裝到三角瓶中,0.1 MPa 滅菌20 min,冷卻后接種,每隔12 h進(jìn)行1次搖瓶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d,干燥10 h后以pH值為7.5的磷酸緩沖溶液浸提1 h配制成粗酶液,對(duì)其進(jìn)行液化酶活力和糖化酶活力的測(cè)定。

    1.2.5.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株酶活的影響

    以最適料水比和最適氮源添加量配制麩皮培養(yǎng)基,并以相同的量分裝到三角瓶中,0.1 MPa滅菌20 min,冷卻后接種,每隔12 h進(jìn)行1次搖瓶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)后3 d開(kāi)始取樣測(cè)酶活,直到培養(yǎng)后7 d。

    1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

    在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取3個(gè)影響因素,以酶活力為因變量,利用DesignExpert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn),分別確定產(chǎn)糖化酶和液化酶的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證[21]。利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)二次響應(yīng)面回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面[22-23]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1? ?耐高溫菌株篩選結(jié)果

    從賒店老酒大曲中分離篩選得到霉菌200株,通過(guò)耐高溫試驗(yàn)最終獲得1株霉菌B8。B8菌株在60 ℃ 時(shí)仍能生長(zhǎng),且最適生長(zhǎng)溫度為45 ℃。B8菌株菌落形態(tài)如圖2所示。

    由圖2可知,B8菌株的菌落培養(yǎng)特征為:蔓延迅速,初為白色,后逐漸變?yōu)楹诤稚?,透明性差。菌絲無(wú)隔膜,假根發(fā)達(dá),分枝呈指狀,孢子囊呈球形或近球形。

    2.2? 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

    利用特異性引物對(duì)B8的18S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,然后進(jìn)行凝膠電泳。由圖3可以看出,擴(kuò)增所得ITS序列長(zhǎng)度約為574 bp,特異性好,與預(yù)期結(jié)果相符。

    將所得B8菌株574 bp ITS序列在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)BLAST程序進(jìn)行同源性比較與分析。取與B8菌ITS序列一致性在99%以上的序列,用MEGA 6.0進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)合生理生化試驗(yàn)表明菌株B8屬于根霉屬(Rhizopus)。

    2.3 單因素條件優(yōu)化結(jié)果

    2.3.1 不同料水比對(duì)菌株酶活的影響 由圖5可知,B8產(chǎn)液化酶和糖化酶活力的能力具有同步性,都是隨著水分的增多酶活力先慢慢升高再降低,即當(dāng)水分含量過(guò)低或過(guò)高時(shí),2種酶活力都比較低,而當(dāng)料水比為5 g ∶3 mL時(shí),2種酶活力最高,此時(shí)液化酶活力達(dá)到30.55 U/g,糖化酶活力達(dá)到 163.66 U/g。在制作麩曲中,水分是很重要的因素,過(guò)多或過(guò)少都會(huì)抑制菌株活力。因此,選擇最佳料水比5 g ∶3 mL做后續(xù)試驗(yàn)。

    2.3.2 不同氮源添加量對(duì)菌株酶活的影響 由圖6可知,液化酶活力和糖化酶活力隨著添加量的增多而升高,當(dāng)?shù)刺砑恿窟_(dá)0.4%時(shí)2種酶活都達(dá)到最大值,此時(shí)液化酶活力為29.88 U/g, 糖化酶活力為142.34 U/g。之后隨著添加量的增多,2種酶活力都呈下降趨勢(shì),過(guò)量的氮源添加量會(huì)使pH值超過(guò)菌株的正常生長(zhǎng)范圍。因此,選擇0.4%氮源為最佳添加量做后續(xù)試驗(yàn)。

    2.3.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株酶活的影響 以料水比為5 g ∶3 mL,氮源添加量為0.4%制作麩曲培養(yǎng)基,滅菌冷卻后接種,從培養(yǎng)后3 d開(kāi)始測(cè)酶活。由圖7可知,液化酶活力在培養(yǎng)后3~5 d呈上升趨勢(shì),培養(yǎng)后5 d達(dá)到酶活最大值,為33.14 U/g;之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加、培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及水分的減少,酶活力下降。糖化酶活力也是在培養(yǎng)后3~5 d逐漸上升,培養(yǎng)后4~6 d的酶活力相差甚小,分別是172.23、175.51 U/g,培養(yǎng)后5 d酶活達(dá)到最大值;之后呈下降趨勢(shì)。因此,最佳培養(yǎng)時(shí)間選擇 5 d 做后續(xù)試驗(yàn)。

    2.4 糖化酶活力響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

    根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[24],設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn),以菌株的糖化酶活力作為響應(yīng)值,選取A含水量(為了便于響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)的處理,料水比以下均采用水的百分含量表示,料水比 5 g ∶2 mL、5 g ∶3 mL、5 g ∶4 mL分別對(duì)應(yīng)含水量29%、38%、44%)、B氮源添加量、C培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)具有顯著影響的因素作為自變量,試驗(yàn)因素的水平選?。汉?9%、38%、44%,氮源添加量0.1%、0.4%、0.7%,培養(yǎng)時(shí)間4、5、6 d,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示。

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