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    內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖能力測(cè)定

    2020-05-11 12:30:11魯海菊謝欣悅陶宏征沈云玫王棟
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:根際土壤生防菌枇杷

    魯海菊 謝欣悅 陶宏征 沈云玫 王棟

    摘要: 采用土壤稀釋分離法與平板計(jì)數(shù)法測(cè)定內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的種群密度,跟蹤測(cè)試90 d內(nèi)其在枇杷根際土壤中的定殖動(dòng)態(tài),結(jié)果表明,P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖過程大致可劃分為3個(gè)階段,前 25 d 內(nèi),菌株相對(duì)含量以10 d為1個(gè)周期呈增減增減變化趨勢(shì),且于10 d時(shí)達(dá)到最大值,為9.52×105 CFU/g,該時(shí)期木霉P3.9菌株在根際土壤中快速適應(yīng)并定殖存活;25~65 d期間,P3.9菌株相對(duì)含量的變化周期延長(zhǎng)至20 d,也呈增減增減變化趨勢(shì),且波動(dòng)幅度較5~25 d期間小,該時(shí)期木霉能夠相對(duì)穩(wěn)定地定殖存活于根際土壤中;65~90 d期間,P3.9 菌株相對(duì)含量在65~75 d期間出現(xiàn)小幅度增加后呈近直線狀下降態(tài)勢(shì);5~75 d期間,P3.9菌株相對(duì)含量維持在105 CFU/g水平上,且75 d時(shí)較接種量只下降1個(gè)數(shù)量級(jí),說明木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的持效期可達(dá)75 d。

    關(guān)鍵詞: 生防菌;內(nèi)生木霉;定殖能力;根際土壤;枇杷;種群密度法;持效期

    中圖分類號(hào): S436.67+9;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)05-0263-05

    近代以來,隨著化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用,化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全、人體健康等方面的負(fù)面影響越發(fā)引起人們的重視,而有關(guān)生防菌的研發(fā)與應(yīng)用也逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)。目前,在所有生防菌制劑中,木霉屬(Trichoderma)真菌制劑產(chǎn)品約占60%[1]。木霉屬真菌在自然界中分布廣泛,是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要組成部分,其菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)對(duì)溫度、濕度、pH值等適應(yīng)范圍廣,且腐生能力強(qiáng),生長(zhǎng)繁殖速度快,可迅速利用營(yíng)養(yǎng)、占據(jù)空間[2-3],能防治多種植物的土傳病害。自1932年Weindling發(fā)現(xiàn)木霉以來[4],人們對(duì)其開展了大量研究,并分離得到多種木霉,而在眾多種類中,綠色木霉、哈茨木霉對(duì)植物病害表現(xiàn)出較好的防治效果[5]。

    木霉菌的成功定殖是其發(fā)揮防治作用的基本前提,且防治效果也部分取決于其存活定殖能力[6]。有關(guān)木霉在土壤中定殖能力的研究已有相關(guān)報(bào)道,杜嬋娟等結(jié)合時(shí)間因子,探究了木霉在土壤空間的定殖規(guī)律[7];肖榮鳳等跟蹤分析了對(duì)茄科尖孢鐮刀菌有拮抗作用的哈茨木霉在土壤中的存活與定殖能力[8];古麗君等明確了施用于草坪土壤的木霉在較短時(shí)期內(nèi)的定殖特性[9]。

    木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病菌具有極強(qiáng)的抑菌及重寄生作用,抗菌譜廣[10],且固體發(fā)酵條件簡(jiǎn)單[11],對(duì)部分化學(xué)農(nóng)藥具有耐藥性[12],能定殖于枇杷各個(gè)器官及其根際土壤[13]。為進(jìn)一步明確木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的施用持效期及最佳施用時(shí)期,本研究采用土壤稀釋分離法與平板計(jì)數(shù)法,跟蹤分析該菌株隨時(shí)間延長(zhǎng)在土壤中的定殖動(dòng)態(tài),以期為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 內(nèi)生木霉(Trichoderma atroviride)P3.9菌株,分離自枇杷主干韌皮部,保存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)標(biāo)本室。1年生枇杷嫁接苗,種植于直徑為23 cm、深為18 cm的營(yíng)養(yǎng)袋中。

    1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖16 g。木霉選擇性培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.2 g,KCl 0.15 g,K2HPO4 0.9 g,(NH4)2SO4 1.0 g,葡萄糖3.0 g,玫瑰紅[四氯四碘螢素鈉鹽(C20H2O5Cl4I4Na2)]0.033 g,瓊脂粉20 g,75%五氯硝基苯可濕性粉劑0.2 g,蒸餾水 1 000 mL,所用試劑為分析純。配制好的培養(yǎng)基在 121 ℃ 下高壓滅菌 30 min,備用。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 木霉菌懸液的準(zhǔn)備與根際土壤接種 將試管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化,待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí),用打孔器取直徑為5 mm的菌餅,接入新的PDA平板中央進(jìn)行培養(yǎng),共培養(yǎng)5皿,28 ℃下培養(yǎng)5~7 d;待菌落長(zhǎng)滿全皿,收集所有培養(yǎng)物至粉碎機(jī)中,加入適量無菌水,充分打勻,制成菌懸液,使孢子濃度為1×106 CFU/mL,備用;將孢子懸浮液澆灌于枇杷嫁接苗根際,500 mL/株,以澆灌等量清水作為對(duì)照。重復(fù)10次,常規(guī)肥水管理。

    1.2.2 木霉定殖能力的測(cè)定 自澆灌木霉孢子懸浮液起90 d內(nèi),每隔5 d用高為0.5 m、鉆頭直徑為38 mm的不銹鋼環(huán)刀土鉆在枇杷嫁接苗根際取土樣1次,采集深度為5~15 cm,每處理隨機(jī)取5株,每株采用5點(diǎn)取樣法采集土樣,并采用四分法充分混勻土樣,備用;稱取1 g土樣置于裝有99 mL無菌水的三角瓶中,在轉(zhuǎn)速為200 r/min的振蕩儀器上振蕩20 min,配制成10-2土壤稀釋懸浮液;靜置2 min后,用無菌微量移液器吸取懸浮液1 mL,加入到 9 mL 無菌水中混勻,即為10-3土壤稀釋懸浮液,如此重復(fù),依次配制成10-4、10-5土壤稀釋懸浮液;取10-5土壤稀釋懸浮液50 μL,采用傾注法加入木霉選擇性平板培養(yǎng)基中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3~5 d,統(tǒng)計(jì)平板上直徑≥10 mm、近圓形、扁平、呈放射狀的無色透明或淺綠色單菌落數(shù)量,重復(fù)5次;計(jì)算土樣中木霉種群密度,計(jì)算公式為

    種群密度=每皿菌落平均值×稀釋倍數(shù)×20×水分系數(shù);

    環(huán)比增長(zhǎng)率=(本期的木霉種群密度-上一期木霉種群密度)/上一期木霉種群密度×100%;

    同比增長(zhǎng)率=(本階段木霉種群密度變化值-上一相同變化階段木霉種群密度變化值)/上一相同變化階段木霉種群密度變化值×100%。

    其中,環(huán)比增長(zhǎng)率、同比增長(zhǎng)率為正值時(shí)表示增長(zhǎng),為負(fù)值時(shí)表示下降。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總計(jì)算、作圖,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5~90 d期間的定殖動(dòng)態(tài)

    由圖1可見,P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖過程大致可劃分為3個(gè)階段,第1階段為前25 d內(nèi),菌株相對(duì)含量以10 d為1周期呈“增減增減”變化趨勢(shì),且于10 d時(shí)達(dá)到最大值,為9.52×105 CFU/g,該時(shí)期木霉P3.9菌株在根際土壤中快速適應(yīng)并定殖存活;第2階段為25~65 d期間,P3.9菌株相對(duì)含量的變化周期延長(zhǎng)至20 d,也呈“增減增減”變化趨勢(shì),且波動(dòng)幅度較5~25 d期間小,該時(shí)期木霉能夠相對(duì)穩(wěn)定地定殖存活于根際土壤中;第3階段為65~90 d期間,P3.9菌株相對(duì)含量在施入土壤65~75 d期間出現(xiàn)小幅度增加后呈近直線狀下降態(tài)勢(shì),75 d時(shí)木霉相對(duì)含量為1.11×105 CFU/g,較接入的初始木霉數(shù)量下降1個(gè)數(shù)量級(jí),而至90 d時(shí)木霉相對(duì)數(shù)量達(dá)到最低值,為4×103 CFU/g。

    2.2 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤3個(gè)階段的定殖動(dòng)態(tài)分析

    2.2.1 第1階段 由表1、圖2、圖3可見,在5~25 d 期間,枇杷根際土壤施入木霉P3.9菌株的處理,木霉相對(duì)含量(孢子數(shù)量)以10 d為1周期呈“增減增減”波動(dòng)變化,且總體減少趨勢(shì),木霉施入土壤后前期相對(duì)含量迅速上升,10 d時(shí)達(dá)到最大值,此時(shí)木霉相對(duì)含量為9.52×105 CFU/g,較接種5 d時(shí)環(huán)比增長(zhǎng)575.18%,隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì),接種處理 15 d 時(shí)木霉相對(duì)含量較10 d時(shí)環(huán)比下降70.27%,之后又上升,接種處理20 d時(shí)菌體相對(duì)含量較15 d時(shí)環(huán)比上升116.96%,之后又下降,接種25 d時(shí)較接種20 d時(shí)環(huán)比下降76.71%;接種處理5~25 d內(nèi),每隔5 d測(cè)得的木霉相對(duì)含量相互間差異極顯著(P<0.01),且10~25 d測(cè)得的木霉相對(duì)含量均高于最初檢測(cè)值,表明該測(cè)試菌株施入土壤后前期定殖能力較強(qiáng);木霉在枇杷根際土壤中的定殖共歷經(jīng)2個(gè)周期(5~15 d、15~25 d),第2個(gè)周期的波動(dòng)幅度低于第1個(gè)周期, 第2個(gè)周期增長(zhǎng)階段較第1個(gè)周期增長(zhǎng)階段同比下降59.19%。未接種的對(duì)照組沒有觀察到木霉菌落的出現(xiàn)。

    2.2.2 第2階段 由表2、圖4、圖5可見,在25~65 d期間,每隔5 d測(cè)得的土壤中木霉相對(duì)含量相互間存在極顯著差異(P<0.01);未接種木霉的對(duì)照組分別于30、50、60 d觀察到極少量木霉,其他調(diào)查時(shí)間未觀察到木霉菌落的出現(xiàn)。該階段,木霉相對(duì)含量變化同樣歷經(jīng)2個(gè)周期(25~45 d、45~65 d),時(shí)間間隔延長(zhǎng)為20 d,木霉相對(duì)含量分別于25~35 d、45~55 d呈上升趨勢(shì),35~45 d、55~65 d呈下降態(tài)勢(shì),在第1個(gè)周期內(nèi),接種處理 35 d 時(shí)的菌體相對(duì)含量較25 d時(shí)環(huán)比上升 93.01%,45 d時(shí)的菌體相對(duì)含量較35 d時(shí)環(huán)比下降67.03%;在第2個(gè)周期內(nèi),接種處理55 d時(shí)的菌體相對(duì)含量較 45 d 時(shí)環(huán)比上升205.49%,65 d時(shí)的菌體相對(duì)含量較55 d時(shí)環(huán)比下降67.27%;第2個(gè)周期增長(zhǎng)階段較第1個(gè)周期增長(zhǎng)階段同比上升40.60%,而下降階段同比上升1.08%,2個(gè)周期的波動(dòng)幅度相似且最值接近,說明該階段測(cè)試菌株定殖存活能力的動(dòng)態(tài)變化趨于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

    2.2.3 第3階段 由表3、圖6可見,在65~90 d期間,隨調(diào)查時(shí)間的延長(zhǎng),接種處理的木霉相對(duì)含量呈先增后減的變化趨勢(shì),沒有明顯的周期性變化規(guī)律,且菌株的定殖存活能力已處于整體測(cè)試階段的最低水平,而未接種木霉的對(duì)照組分別于70、75 d時(shí)觀測(cè)到有少量木霉出現(xiàn),而其他調(diào)查時(shí)間均未發(fā)現(xiàn);接種處理70 d時(shí)的木霉相對(duì)含量達(dá)到本階段最大值,為1.45×105 CFU/g,較65 d時(shí)環(huán)比上升59.34%,而75 d時(shí)的木霉相對(duì)含量較 70 d 時(shí)環(huán)比下降23.45%;接種處理75 d后菌體相對(duì)含量呈近直線下降趨勢(shì),90 d時(shí)達(dá)到最低值,僅為4.00×103 CFU/g,此時(shí)若無外力干預(yù),該菌株在施用土壤中可能無法繼續(xù)存活并發(fā)揮生防作用。

    3 結(jié)論與討論

    有研究表明,生防菌的快速定殖能力是提高其對(duì)土傳病害防治效果的重要因素之一[14]。許傳坤等研究表明,木霉的萌發(fā)會(huì)受到土壤抑真菌作用的抑制[15]。賀字典等研究發(fā)現(xiàn),某些木霉在施入土壤后會(huì)歷經(jīng)一個(gè)適應(yīng)過程,一旦適應(yīng)后其定殖數(shù)量會(huì)迅速上升[16]??灯贾サ劝l(fā)現(xiàn),在施入土壤的較短時(shí)期內(nèi),木霉數(shù)量會(huì)迅速到達(dá)峰值,之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸呈下降趨勢(shì)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),木霉P3.9菌株在施入土壤的最初10 d內(nèi),相對(duì)含量呈指數(shù)形增長(zhǎng),接種10 d時(shí)達(dá)到最大值,隨后開始回落,并以 10 d 為1個(gè)周期呈“增減增減”變化趨勢(shì),且增減幅度相對(duì)較大,而自接種處理25 d開始,呈以20 d為周期的“增減增減”變化趨勢(shì),增減幅度減小,說明木霉P3.9菌株在歷經(jīng)較短適應(yīng)期后快速定殖于施用土壤中。

    古麗君等研究發(fā)現(xiàn),深綠木霉接種于土壤后,前期存在大量孢子,隨著調(diào)查時(shí)間的延長(zhǎng),孢子數(shù)量呈先逐漸下降、再略有上升、后保持相對(duì)穩(wěn)定的變化趨勢(shì),穩(wěn)定時(shí)木霉在土壤中的相對(duì)含量為 104 CFU/g[9]。徐瑞富等研究發(fā)現(xiàn),木霉在未滅菌耕作層、亞表層中的定殖變化趨勢(shì)呈先增后減、波浪狀生長(zhǎng)曲線[18]。Orr等研究表明,將1株木霉菌株存放在持續(xù)保濕的環(huán)境中,3 d后菌落數(shù)量變化與時(shí)間的增加呈正相關(guān)關(guān)系,保存時(shí)間延長(zhǎng)到5 d后,隨保存環(huán)境的改變,菌株含量呈下降趨勢(shì)[19]。本研究結(jié)果表明,內(nèi)生木霉P3.9菌株接種處理75 d時(shí)的相對(duì)含量雖較接入時(shí)的初始菌量下降近1個(gè)數(shù)量級(jí),但土壤中該菌體相對(duì)含量仍能穩(wěn)定在 105 CFU/g,說明木霉P3.9菌株相對(duì)含量相對(duì)穩(wěn)定,持續(xù)期約為75 d,優(yōu)于古麗君等研究報(bào)道的菌株[9,20],這可為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

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    收 稿日期:2019-02-15

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31660147);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(編號(hào):2016FB066);紅河學(xué)院應(yīng)用型科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):XJY15Z06)。

    作者簡(jiǎn)介:魯海菊(1978—),女,云南大理人,博士,教授,從事植物病理學(xué)研究。E-mail:luhaiju2011@126.com。

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