響應(yīng)面法優(yōu)化野生白靈菇菌絲生長(zhǎng)條件

許俊齊 賈君 徐超 凡軍民 謝春芹 曹淼 魏壯壯

摘要： 以新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣野生白靈菇為研究對(duì)象，探討其菌絲培養(yǎng)階段pH值、溫度、碳源、氮源、碳氮比（C/N）對(duì)野生白靈菇菌絲生長(zhǎng)特性的影響。結(jié)果表明，pH值為6.5～7.5條件下，白靈菇菌絲生長(zhǎng)速度保持在相對(duì)較高水平，培養(yǎng)溫度為24～26 ℃較利于白靈菇菌絲的生長(zhǎng);白靈菇菌絲培養(yǎng)良好的碳源為蔗糖、麥芽糖，氮源為蛋白胨、酵母浸膏;培養(yǎng)基中，C/N為20 ∶1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)最快。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，菌絲生長(zhǎng)較優(yōu)的條件為溫度24 ℃、pH值6.5、碳氮比21? ∶ 1，此條件下白靈菇菌落直徑為58.13 mm，菌絲生長(zhǎng)速度為4.79 mm/d，與預(yù)測(cè)值相符。

關(guān)鍵詞： 白靈菇;菌絲特性;溫度;碳氮比;pH值;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)： S646.1+40.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0137-06

白靈菇（Pleurotus nebrodensis）別稱天山白靈芝，擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬（Pleurotus）真菌[1]，子實(shí)體通體潔白，菇體肥大，蓋厚柄粗，脆嫩可口，質(zhì)地密實(shí)，香味濃郁，具有藥用和保健功能。白靈菇營(yíng)養(yǎng)豐富，人體必需的8種氨基酸含量相對(duì)較高，占其總氨基酸含量的35%，對(duì)提高人體非特異性免疫功能具有良好的促進(jìn)作用，是一種珍稀的天然保健食品[2-7]，存在較好的市場(chǎng)潛力和經(jīng)濟(jì)效益。

白靈菇在我國(guó)僅分布于新疆維吾爾自治區(qū)的干旱沙漠地區(qū)，故又有“天山神菇”“西天白靈菇”之稱[8-9]，其中，新疆塔城縣白靈菇具有朵型大、顏色潔白、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)以新疆塔城縣白靈菇菌種為對(duì)象，探討其菌絲培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)特性，以選育出適合江蘇地區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的菌株，增加江蘇白靈菇品類，并改進(jìn)其現(xiàn)有栽培技術(shù)，為新疆白靈菇的成功引種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 白靈菇菌種，由新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣白靈菇種植基地提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備 JA2003型電子天平，上海天平儀器廠生產(chǎn);美的（Midea）WK2102型電磁爐，美的集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);SW-CJ-LF型凈化操作臺(tái)，圣欣科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);LRH-150B型恒溫培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn);XFS-280A型高壓滅菌鍋，上海尚道儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蛋白胨2.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g，瓊脂粉12.0 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)的影響 將菌齡與厚度基本一致、顏色潔白、直徑為5 mm的白靈菇菌種圓片，分別接種到1個(gè)條件或物質(zhì)發(fā)生變化、其他條件或物質(zhì)相對(duì)固定不變的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，相對(duì)濕度為75%～80%、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng);待菌絲萌發(fā)，采用“十”字交叉法測(cè)定菌落直徑，每隔12 h測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量5 d，測(cè)量10次，計(jì)算菌絲日均生長(zhǎng)速率及菌絲長(zhǎng)勢(shì)。試驗(yàn)設(shè)置不同pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5;設(shè)置光照培養(yǎng)箱不同溫度為20、22、24、26、28 ℃;設(shè)置不同碳源為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖;設(shè)置不同氮源為硫酸銨、酵母浸膏、硝酸鉀、蛋白胨;固定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蔗糖含量不變，變換蛋白胨含量，設(shè)置不同碳氮比（C/N）為10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以菌絲生長(zhǎng)速度平均值、菌絲培養(yǎng)5 d時(shí)的菌落直徑為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)溫度、pH值、C/N這3個(gè)條件進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Minitab數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、WPS 2016軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，利用Design-expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)曲面法獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)的影響

2.1.1 pH 值 由圖1可知，白靈菇菌絲在pH值為4.5～8.5的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，且菌絲生長(zhǎng)速度在不同pH值條件下相互間差異不顯著（P>0.05）;隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，白靈菇菌絲生長(zhǎng)速度整體呈先增加后降低趨勢(shì)，培養(yǎng)3 d時(shí)菌絲日生長(zhǎng)速度相對(duì)最高，這可能與培養(yǎng)基中菌絲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗有關(guān);pH值為8.5的較高pH值條件及pH值為4.5、5.5的較低pH值條件下，菌絲日生長(zhǎng)速度相對(duì)較低，而pH值為6.5、7.5條件下，菌絲日生長(zhǎng)速度保持在4.23 mm/d以上，且菌絲潔白、濃密。因此，白靈菇菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基相對(duì)最適合的pH值為6.5～7.5。

2.1.2 培養(yǎng)溫度 由表1可知，在不同培養(yǎng)溫度條件下，白靈菇菌絲生長(zhǎng)速度存在明顯差異;隨培養(yǎng)溫度的增加，白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度呈先增加后下降趨勢(shì)，其中，24 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)到最大，菌絲日均生長(zhǎng)速度達(dá)到4.482 mm/d，與26、28 ℃培養(yǎng)的差異不顯著（P>0.05），極顯著高于22、20 ℃條件下培養(yǎng)的菌絲（P<0.01）;24、26 ℃條件下培養(yǎng)的白靈菇其菌絲潔白、濃密、粗壯，而28 ℃條件下培養(yǎng)的白靈菇其菌絲日均生長(zhǎng)速度較24、26 ℃的有所下降，菌絲色澤偏黃，且較為稀松，28 ℃的溫度條件已不適宜白靈菇菌絲生長(zhǎng)。因此，白靈菇菌絲生長(zhǎng)相對(duì)最適合的溫度為24～26 ℃。

2.1.3 碳源 蔗糖、麥芽糖為雙糖，常在培養(yǎng)基中被用作小分子碳源。由表2可知，白靈菇菌絲在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖這5種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中，以蔗糖、麥芽糖作為碳源相對(duì)較好，白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度相對(duì)較高，分別為4.504、4.450 mm/d，極顯著高于其他3種碳源（P<0.01）;以葡萄糖、可溶性淀粉、果糖作為碳源培養(yǎng)白靈菇，其菌絲日均生長(zhǎng)速度相互間存在顯著差異（P<0.05），其中以果糖作為碳源的菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)最小。因此，蔗糖、麥芽糖作為碳源較適合白靈菇菌絲的生長(zhǎng)，綜合考慮以蔗糖作為碳源白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度較為平穩(wěn)，且價(jià)格低廉，較易獲得，故選擇蔗糖為白靈菇菌絲培養(yǎng)的較佳碳源。

2.1.4 氮源 由表3可知，白靈菇菌絲培養(yǎng)可利用硫酸銨、酵母浸膏、硝酸鉀、蛋白胨作為氮源，但菌絲生長(zhǎng)速度有明顯不同，其中，酵母浸膏、蛋白胨作為氮源的白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度相對(duì)較高，分別為4.192、4.014 mm/d，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響相互間差異不顯著（P>0.05），但極顯著高于其他2種氮源（P<0.01）。觀察菌絲外觀發(fā)現(xiàn)，以硫酸銨、硝酸鉀為氮源的白靈菇菌絲較為稀松、顏色淺白，而以酵母浸膏、蛋白胨為氮源的白靈菇菌絲濃密，且菌落直徑明顯大于其他2組。因此，白靈菇菌絲生長(zhǎng)的較佳氮源為酵母浸膏與蛋白胨。

2.1.5 碳氮比 由表4可知，在不同碳氮比條件下，白靈菇菌絲都能生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度有明顯不同;C/N為20 ∶ 1時(shí)，白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度為4.378 mm/d，顯著高于其他4個(gè)處理（P<0.05）;C/N為25 ∶ 1的白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度與C/N為15 ∶ 1的處理相互間差異不顯著（P>0.05），C/N為10 ∶ 1的白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度與C/N為30 ∶ 1 的處理相互間差異不顯著。觀察菌絲外觀狀況發(fā)現(xiàn)，C/N分別為20 ∶ 1、25 ∶ 1培養(yǎng)基培養(yǎng)的白靈菇菌絲濃密健壯，菌絲生長(zhǎng)優(yōu)良?？梢姡嘴`菇為典型的木腐菌，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段對(duì)碳源的需求相對(duì)較大，當(dāng)C/N為20 ∶ 1時(shí)利于白靈菇菌絲的生長(zhǎng)。

2.2 白靈菇菌絲生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)多元回歸結(jié)果 采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表5試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得出溫度（A）、pH值（B）、C/N（C）與菌絲生長(zhǎng)速度（Y1）、菌落直徑（Y2）這2個(gè)響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而得到二次回歸方程（模型）分別為：

Y1=4.78+0.10A+0.099B+0.066C-0.11AB+0.120AC+0.07BC-0.23A2-0.33B2-0.26C2;

Y2= 57.28+3.43A+0.420B+3.330C-0.23AB-0.205AC-0.07BC-5.94A2-4.36B2-5.24C2。

由表6可知，菌絲生長(zhǎng)速度、菌落直徑模型P值均<0.0001，影響極顯著，失擬項(xiàng)P值分別為0.255 2、0.116 2，影響不顯著（P>0.05），說明試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑侠?，試?yàn)設(shè)計(jì)可行，回歸方程能準(zhǔn)確反映溫度、pH值、C/N比對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)速度、菌落直徑的影響;菌絲生長(zhǎng)速度、菌落直徑模型決定系數(shù)R2分別為0.986 6、0.989 8，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj分別為0.969 4、0.968 0，說明模型擬合度較好，誤差較小，可用于白靈菇生長(zhǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)的分析與預(yù)測(cè);菌絲生長(zhǎng)速度模型中，一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)模型影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AB對(duì)模型影響顯著（P<0.05），交互項(xiàng)BC對(duì)模型影響不顯著（P>0.05），而白靈菇菌落直徑模型中，一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)模型影響極顯著，一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AB、BC對(duì)模型影響不顯著。

2.2.2 因素間的交互作用 響應(yīng)面三維圖可反映各因素之間的交互作用，響應(yīng)曲面坡度越陡峭，說明響應(yīng)值受到相應(yīng)因素變化的影響較為顯著。由圖2、圖3可知，溫度、pH值、C/N各兩因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度、菌落直徑響應(yīng)曲面較為陡峭，交互作用較為明顯，與回歸模型分析結(jié)果較為一致。

2.2.3 菌絲生長(zhǎng)條件優(yōu)化與驗(yàn)證 根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程，計(jì)算得到白靈菇菌落直徑相對(duì)最大的條件為溫度24.24 ℃、pH值6.02、C/N 21.35 ∶ 1，此條件下菌落直徑預(yù)測(cè)值為58.152 9 mm;菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)最優(yōu)的條件為溫度24.24 ℃、pH值6.565、C/N 21.05 ∶ 1，此條件下菌絲生長(zhǎng)速度預(yù)測(cè)值為4.805 57 mm/d。為便于實(shí)際生產(chǎn)操作，將優(yōu)化條件調(diào)整為溫度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 1，此條件下測(cè)得的菌落直徑為58.13 mm，菌絲生長(zhǎng)速度為 4.79 mm/d，與Design-Expert 8.0.6得出的最優(yōu)參數(shù)預(yù)測(cè)值較為吻合，可見該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可靠有效。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣白靈菇菌絲在不同pH值培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中，在pH值為6.5的培養(yǎng)基上白靈菇菌絲生長(zhǎng)發(fā)育良好;適宜白靈菇菌絲生長(zhǎng)的相對(duì)最佳溫度為24～26 ℃，此條件下培養(yǎng)的白靈菇菌絲潔白、濃密、粗壯;白靈菇菌絲在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖這5種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中以蔗糖作為碳源相對(duì)最好，白靈菇菌絲日均生長(zhǎng)速度較為平穩(wěn)，且蔗糖價(jià)格低廉，較易獲得;酵母浸膏是白靈菇菌絲生長(zhǎng)相對(duì)較好的氮源，培養(yǎng)基中C/N為20 ∶ 1時(shí)更利于白靈菇菌絲的生長(zhǎng)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，分別以菌落直徑、菌絲生長(zhǎng)速度為響應(yīng)值，以溫度、pH值、C/N為影響因子設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)曲面試驗(yàn)，對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，得到的二次回歸模型相關(guān)性極顯著（P<0.01），準(zhǔn)確度、精密度較高，并得出白靈菇菌絲最優(yōu)生長(zhǎng)參數(shù)為溫度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 0，此條件下測(cè)得菌落直徑為58.13 mm，菌絲生長(zhǎng)速度為4.79 mm/d。

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收 稿日期：2019-01-24

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技項(xiàng)目——現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心平臺(tái)建設(shè)（編號(hào)：2014KJ26）。

作者簡(jiǎn)介：許俊齊（1986—），男，陜西西安人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏技術(shù)研究。E-mail：wozaijurong@163.com。

通信作者：賈 君（1966—），博士，教授，從事食品質(zhì)量分析、農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)及加工研究。E-mail：772805883@qq.com。