復(fù)合益生菌乳膏劑的制備和對斷奶仔豬生長性能的影響

魏秀蓮，張 樂，婁迎霞，吳長金，曹 林，張 靜，陳小全，劉雪連

（1.北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107；2.飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 100192；3.浙江大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司，浙江 321016；4.哈爾濱大北農(nóng)牧業(yè)科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150431）

1 簡介

畜禽養(yǎng)殖中抗生素的濫用導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性，世界各國陸續(xù)禁止抗生素作為促生長添加劑的使用。近年來，生豬生產(chǎn)中，已廣泛使用益生菌來替代抗生素，提高豬的生產(chǎn)性能[1]。使用益生菌可改善豬只腸道菌群結(jié)構(gòu)、抑制有害菌定殖，預(yù)防豬只消化道疾病[2]。

已有多項研究探討單一菌株對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響，包括約氏桿菌和干酪乳桿菌等[3-4]。當(dāng)前，人們對于益生菌飼料添加劑的研究正從單一菌株向復(fù)合菌株轉(zhuǎn)變[5-6]。因此，根據(jù)哺乳仔豬階段營養(yǎng)物質(zhì)的需求，基于前期工作基礎(chǔ)，選擇了干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）， 屎 腸 球 菌（Enterococcus faecium），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）組合成不同配方，將其添加到乳膏劑基質(zhì)中，制備了4種復(fù)合益生菌乳膏劑，測試其在常溫下的保存穩(wěn)定性，并將優(yōu)化配方作為飼料添加劑添加到斷奶仔豬日糧中，評估其對斷奶仔豬生長性能的影響，包括平均日增重、平均日采食量、飼料增重比和末均重，以及腹瀉率。

2 材料和方法

2.1 復(fù)合益生菌乳膏劑的制備

參考北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《哺乳仔豬用0.2%復(fù)合預(yù)混合飼料（源生態(tài)軟酪乳乳膏劑）》（Q/HDDBN0077-2019）制備乳膏劑基質(zhì)。以1 000 g乳膏劑基質(zhì)為例，將濃縮低蛋白乳清粉（430 g）、玉米淀粉（210 g）、蔗糖脂肪酸酯（20 g）、黃原膠（2 g）、殼寡糖（0.5 g）和去離子水混合均勻（338 g），70 ℃巴氏滅菌30 min，使用乳化機(jī)以10 000 r/min高速乳化10 min。

將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），屎腸球菌（Enterococcus faecium），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii） 4 株菌進(jìn)行組合，確定如下4個配方，配方1：干酪乳桿菌+屎腸球菌+約氏乳桿菌；配方2：干酪乳桿菌+屎腸球菌+植物乳桿菌；配方3：干酪乳桿菌+屎腸球菌；配方4：干酪乳桿菌+屎腸球菌+植物乳桿菌+約氏乳桿菌。將菌粉組合配制，加入到乳化好的乳膏劑基質(zhì)中，初始活菌數(shù)約為109CFU/g乳膏劑。

2.2 復(fù)合益生菌乳膏劑的穩(wěn)定性評估

將所制備的4種配方的復(fù)合益生菌乳膏劑，在室溫下儲存56 d，在 0、7、14、21、28、35、42、49和56 d分別進(jìn)行活菌計數(shù)。具體方法為：取乳膏劑樣品10 g，加入無菌玻璃珠10～15顆，無菌水100 mL，室溫下180 r/min震蕩混勻10 min，梯度稀釋至10-6、10-7、10-8和10-94個濃度，取稀釋液1 mL接種于MRS培養(yǎng)基中，涂布計數(shù)，每個濃度做3個平行。同時使用pH計測定乳膏劑的pH（梅特勒-托利多，F(xiàn)E20）。

2.3 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬生長性能的影響

2.3.1 動物選擇與試驗設(shè)計

從母豬胎次一致、產(chǎn)期相同的20窩中選取體重相似、健康狀況良好的14日齡杜h長h大三元雜健康斷奶仔豬80頭，按照窩別和體重隨機(jī)分成2個組（復(fù)合菌乳膏劑組、對照組），每個組4個重復(fù)，每個重復(fù)10頭豬，試驗進(jìn)行28 d。試驗日糧參照NRC（2012）體重5～7 kg仔豬營養(yǎng)需要飼喂基礎(chǔ)日糧，復(fù)合菌乳膏劑組每頭豬添加2 g乳膏劑，對照組僅飼喂基礎(chǔ)日糧。

2.3.2 飼養(yǎng)管理

試驗豬飼養(yǎng)于玉田豬場溫控仔豬舍中，早、中、晚各加一次料，觀察各欄仔豬采食量，保證不同采食量的仔豬都能完全自由采食和飲水。

2.3.3 指標(biāo)測定

1）平均日增重（Average daily gain，ADG）。試驗豬在試驗開始、第15天、第29天時，早晨8：00空腹稱重（前一天20：00斷料），ADG（kg）=[末欄重（kg）-始欄重（kg）] / [每欄仔豬頭數(shù)h 飼養(yǎng)天數(shù)（d）]。

2）日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）。以欄為單位記錄每天的投料量與剩料量，求出試驗期間每欄總的投料量與剩料量，ADFI（kg）=[投料量（kg）-剩料量（kg）] / [每欄仔豬頭數(shù)h 飼養(yǎng)天數(shù)（d）]。

3）飼料轉(zhuǎn)化率（增重比）（Feed to Gain Ratio，F(xiàn)/G）。F/G=ADFI（kg）/ADG（kg）。

4）腹瀉率（Diarrhea Rate，DR）：每天記錄每個重復(fù)中腹瀉的豬只數(shù)，求出該重復(fù)的總腹瀉頭次數(shù)，將其除以該重復(fù)的總飼養(yǎng)頭次數(shù)，即得出該重復(fù)的腹瀉率。最后算出該處理各重復(fù)腹瀉率的平均值。腹瀉的標(biāo)準(zhǔn)是，糞便不形成穩(wěn)定固體，仔豬有明顯的稀便肛尾粘著現(xiàn)象。DR（%） = [每欄總腹瀉頭日次數(shù)/（每欄仔豬頭數(shù)h 飼養(yǎng)天數(shù)（d））]h100%。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用平均值f標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式表示。采用SAS 8.0程序GLM過程進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較用t檢驗（Student's t test），多重比較用鄧肯法（Duncan test），以P＜0.05為顯著水平。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)合益生菌乳膏劑的穩(wěn)定性

所制備的4種配方的復(fù)合益生菌乳膏劑基質(zhì)相同，所含菌株種類不同，在室溫下的貯藏穩(wěn)定性見圖1。由圖1A可見，由干酪乳桿菌、屎腸球菌和約氏乳桿菌組合制備的配方1穩(wěn)定性最好，在室溫下儲存56 d仍能維持較高的活菌數(shù)（＞108cfu/g），而其他配方的活菌數(shù)在28 d后開始迅速下降。圖1B為乳膏劑的pH變化，配方1的pH在最初的7 d內(nèi)下降，隨后保持不變，在56 d的保存期中，4個配方乳膏劑的pH均有所下降，其中配方1的pH變化相對較少。因此，選取配方1復(fù)合益生菌乳膏劑用于后續(xù)仔豬生長性能評估。

3.2 復(fù)合益生菌乳膏劑對斷奶仔豬生長性能的影響

日糧中添加復(fù)合益生菌乳膏劑組中，早期斷奶仔豬末均重為(18.22f0.67)kg/頭，顯著高于對照組的(17.12f0.64)kg/頭（P=0.026）。復(fù)合益生菌乳膏劑組所得的平均日增重ADG為(485f30)g/頭，顯著高于對照組的 (432f28)g/頭（P=0.019）。2組間平均日采食量ADFI沒有顯著差異（P＞0.05）。計算所得的復(fù)合益生菌乳膏劑組和對照組的飼料增重比F/G分別為1.48f0.08和1.69f0.13，飼喂復(fù)合益生菌乳膏劑組的飼料增重比低于對照組，結(jié)果具有顯著性（P=0.004）。飼喂復(fù)合益生菌乳膏劑組和對照組的腹瀉率DR分別為1.09 %和0.69 %。在試驗過程中，飼喂復(fù)合益生菌乳膏劑組出現(xiàn)了黃色的不成型的糞便，相對比較黏稠，一定程度上干擾腹瀉情況的判斷。

圖1 4種配方復(fù)合益生菌乳膏劑在常溫下儲存0～56 d時的活菌數(shù)（A）和pH（B）。

表1 復(fù)合益生菌乳膏劑對早期斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

4 討論

早期斷奶仔豬因其日糧和飼養(yǎng)環(huán)境的變化，易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，包括腹瀉和死亡等，因此需從調(diào)控營養(yǎng)、建立健康腸道菌群等多方面對斷奶仔豬進(jìn)行保健[7]。目前，已有多項研究證實，給斷奶仔豬飼喂益生菌可提高仔豬腸道健康，增加免疫力及機(jī)體的抵抗能力，促進(jìn)其自身健康生長[3-6]。朱原等綜述了益生菌在建立仔豬健康腸道環(huán)境中的作用，主要通過病原抑制、改善腸上皮屏障功能、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道微生物組成和生成短鏈脂肪酸等途徑[1-2]。

已有多項研究探索了單一菌株對斷奶仔豬生長性能的影響，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌可降低仔豬腹瀉率，并提高其抗氧化能力，但其對平均日增重、平均日采食量和料重比沒有影響[4]。另外，在飼料中添加約氏桿菌可顯著改善斷奶仔豬耗料增重比，并提高其肝臟指數(shù)，同時，病理觀察結(jié)果顯示添加約氏桿菌對斷奶仔豬的各組織均無不良影響[3]。多種菌株通過不同途徑改善仔豬生長性能。

近年來，復(fù)合益生菌的使用日益頻繁，多菌株協(xié)同作用效果往往超過單一菌株。張德曉等使用凝結(jié)芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌制備復(fù)合菌制劑，其可改善仔豬29～60日齡平均日采食量、平均日增重和料重比，但結(jié)果并不顯著[5]。楊玲等探討飼糧中添加含丁酸梭菌的復(fù)合益生菌對斷奶仔豬飼糧中的抗生素替代效果，分別用含丁酸梭菌的復(fù)合益生菌替代0%、50%和100%的抗生素。觀察到替代100%抗生素時可實現(xiàn)其生長性能與抗生素組效果相當(dāng)，而且能降低腹瀉率[8]。曾秀玲等研究了枯草芽胞桿菌、酵母菌和乳酸菌三者組合的復(fù)合益生菌對早期斷奶仔豬生長性能和體液免疫水平的影響，觀察到飼喂益生菌的仔豬日增重增加，體液免疫功能提升，且腹瀉率顯著降低[9]。祝永才報道了使用釀酒酵母菌-枯草芽孢桿菌復(fù)合益生菌可有效提高斷奶仔豬的生長性能，在基礎(chǔ)日糧中添加0.30%復(fù)合益生菌，可顯著提高試驗組末重、平均日增重和平均日采食量[10]。與之前報道一致，此次研究中，飼喂由干酪乳桿菌、屎腸球菌和約氏乳桿菌制備的復(fù)合菌乳膏劑的斷奶仔豬日增重、飼料增重比和末均重均顯著優(yōu)于對照組。新采用的乳膏劑劑型可提高益生菌存活率，從而提高益生菌的作用效果。同時，我們還觀察到飼喂復(fù)合菌乳膏劑的仔豬腹瀉率略微升高，這可能是由于試驗中部分仔豬出現(xiàn)了糞便不成型的情況，因此干擾了腹瀉的判斷和統(tǒng)計。之前有研究報道，在基礎(chǔ)日糧中添加0.20%復(fù)合益生菌，其腹瀉率顯著高于添加0.30%復(fù)合益生菌[10]，因此，可考慮繼續(xù)優(yōu)化乳膏劑中活菌數(shù)來改善這一問題。

目前，大多數(shù)關(guān)于復(fù)合益生菌的研究集中在菌株類型，此次研究首次改善了益生菌飼喂制劑的劑型，用乳膏型替代液體[6]和固態(tài)粉[3,4]等兩種傳統(tǒng)劑型。對于液態(tài)菌制劑，往往需要在低溫下保存，方可保持菌活性；而固態(tài)菌制劑溶解性差，生產(chǎn)成本高，在凍干制備過程中會影響菌活性。在此次的研究結(jié)果中，將4種常用復(fù)合菌進(jìn)行組合，經(jīng)過優(yōu)化的益生菌乳膏劑活性成分為干酪乳桿菌、屎腸球菌[11]和約氏乳桿菌，由這3種菌組合成的復(fù)合菌制劑在常溫下保存56 d仍可保持活菌數(shù)高于108cfu/g，在方便儲存和使用的同時，仍可保證益生菌制劑的效果。

5 結(jié)論

此次研究中，使用干酪乳桿菌、屎腸球菌和約氏乳桿菌制備了復(fù)合益生菌乳膏劑，在室溫下可穩(wěn)定保存超過1個月，在斷奶仔豬中使用可有效提高平均日增重和末均重、降低飼料增重比，從而提高其生長性能，在仔豬保健中可發(fā)揮有效作用。