不同消毒劑對冠狀病毒消毒效果比較研究

（天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司,天津 300308）

2019年12月中旬，中國武漢發(fā)生“不明原因肺炎”，后經(jīng)研究人員分離鑒定后認(rèn)定是由一種新型的冠狀病毒引起的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病[1]。2020年2月11日世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒命名為 COVID-19[2]。21世紀(jì)以來除COVID-19外，還出現(xiàn)2種致病性較高的新型人冠狀病毒，2003年的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS）、2012年的中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（MERS）。冠狀病毒[3]是一類有包膜，包膜上有棘突的單股正鏈RNA病毒，整個病毒像王冠或日冕而得名，這類病毒廣泛存在于自然界中，屬于人畜共患病毒。新型冠狀病毒肺炎雖然是自限性疾病，但有一定的致死率，且該病毒為傳染性極強(qiáng)，至今尚無有效疫苗和治療方法。目前預(yù)防該病毒感染最行之有效的手段就是隔離與消毒[4]。

目前，常用84消毒劑和酒精是單方消毒劑，但日常生活中使用84消毒劑會導(dǎo)致一定的漂白及腐蝕性，酒精在封閉環(huán)境中使用具有一定危險性。獸用消毒劑很多是復(fù)方消毒劑，為了評估這些消毒劑對于冠狀病毒是否有效，同時在消毒劑評估上掌握一種替代的評價方法，此研究建立了以冠狀病毒-豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為指示病毒的評價模型，重點(diǎn)評估消毒劑最低有效濃度和最短作用時間，以期為冠狀病毒的消毒劑評估提供了一種可行和敏感的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株

Vero-E6細(xì)胞和純凈穩(wěn)定傳代PEDV（ZJ08株）毒株均由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司研究院饋贈。

1.2 待測消毒劑

安立消（月芐三甲氯銨，雙鏈季銨鹽）、衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合物粉 含氯≥10%）、新歐福（戊二醛-葵甲溴銨）、二氯異氰脲酸鈉（含氯20%）、84消毒液（含氯4.5%）、酒精。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最大無毒濃度摸索

將各種消毒劑用細(xì)胞維持液按照100倍稀釋后接種鋪滿Vero-E6細(xì)胞的細(xì)胞板，觀察細(xì)胞變化，無細(xì)胞變化的最小稀釋度為該消毒劑的最大無毒濃度。

1.3.2 最低有效濃度（病毒滅活率）測定

將消毒劑從1.3.1中最大無毒濃度開始進(jìn)行100系列稀釋，與病毒液進(jìn)行等體積混合，室溫下靜置30 min使消毒劑與病毒液充分作用。作用完后，加入相應(yīng)中和劑終止實(shí)驗(yàn)，將混合物用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，測定TCID50，同時作無消毒劑、無病毒的空白對照；取長滿Vero-E6細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板作原病毒對照板，測定與消毒劑作用前病毒液TCID50；另設(shè)75%乙醇做消毒劑對照。將接種后的96孔細(xì)胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 h，分別計算有消毒劑和無消毒劑的TCID50，計算病毒滅活率和消毒前后病毒下降滴度Log10TCID50/100μL。

病毒滅活率%=（消毒前病毒滴度-消毒后病毒滴度）/消毒前病毒滴度 100%

1.3.3 最短作用時間測定

將消毒劑稀釋到1.3.2中測定最低有效濃度的中間濃度，與病毒液進(jìn)行等體積混合，室溫下分別靜置1 min、5 min、10 min使消毒劑與病毒液充分作用。作用完后，加入相應(yīng)中和劑終止實(shí)驗(yàn)，將混合物用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，測定TCID50，同時作無消毒劑、無病毒的空白對照。另取長滿Vero-E6細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板作原病毒對照板，測定與消毒劑作用前病毒液TCID50。將接種后的96孔細(xì)胞板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 h，分別計算有消毒劑和無消毒劑的TCID50，計算消毒前后病毒下降滴度Log10TCID50/100μL。

1.3.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：消毒后滴度下降≥104即為有效。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 最低有效濃度

新歐福最低有效濃度為1:500；安立消最低有效濃度為1:800；衛(wèi)清寧最低有效濃度為1:1 600；二氯異氰脲酸鈉的最低有效濃度為1:1 000；84消毒液最低有效濃度為1:100。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2 最短作用時間測定

含氯制劑二氯異氰脲酸鈉粉、84消毒液、衛(wèi)清寧（主要成分為過硫酸氫鉀復(fù)合粉）與病毒作用1 min后，為毒價降低106.5，能夠有效殺滅豬病毒性腹瀉病毒PEDV，季銨鹽類消毒劑安立消和醛類消毒劑新歐福、酒精最短作用時間>10 min，需要更長的時間才能殺滅病毒。不同作用時間消毒效果詳見表2。

3 討論

新型冠狀病毒COVID-19與SARS病毒以相同的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，與蝙蝠相關(guān)病毒基因組測序相似型達(dá)87.1%，屬于SARS相關(guān)冠狀病毒。但傳染性與致病性均高于2003年SARS病毒[5]，截止本文發(fā)稿前，該病毒導(dǎo)致的確診病例達(dá)超7萬多例，還有疑似5萬多例，累計死亡超過2 600例，感染和死亡人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SARS病毒。

根據(jù)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第6版）規(guī)定，COVID-19病毒屬于β屬冠狀病毒，乙醚、酒精、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等均能有效殺滅病毒。有專家指出有效消毒是保證豬場生物安全的必要手段[6]。王成新認(rèn)為，有效消毒必須選擇適用的消毒劑，必須針對不同的消毒對象采用不同的方法。此研究中，將84消毒劑、酒精和常見獸用復(fù)方消毒劑建立了一種利用Vero-E6細(xì)胞進(jìn)行消毒效果評估[7-8]，利用細(xì)胞將PEDV-ZJ08株作為指示病毒，通過進(jìn)行消毒前后病毒效價測定對比，對消毒劑殺滅冠狀病毒的效果進(jìn)行評估的模型。這種方法比其他消毒劑評價方式更加敏感，且可專門針對冠狀病毒進(jìn)行消毒劑評估，在新冠疫情期間豬場人員、環(huán)境消毒非常具有指導(dǎo)意義。

表1 不同類消毒劑感作30 min時的最低有效濃度

表2 不同類消毒劑與病毒作用不同時間病毒滴度的降低值

共測定6種消毒劑，其中安立消（月芐三甲氯銨，雙鏈季銨鹽）、衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合粉）、二氯異氰脲酸鈉粉、84消毒液均為含氯消毒劑；新歐福（戊二醛-葵甲溴銨）為醛類消毒劑；75%乙醇為醇類消毒劑。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，所測消毒劑均能有效殺滅冠狀病毒，但不同消毒劑有效的最低有效濃度有差異，最短作用時間結(jié)果顯示，含氯消毒劑對于殺滅冠狀病毒效果迅速，可在1 min內(nèi)迅速殺滅PEDV，而其他種類消毒劑作用超過10 min才能達(dá)到殺滅冠狀病毒的效果。衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合粉）消毒效果明顯優(yōu)于其他消毒劑。84消毒劑的最大稀釋到1:100倍可以使PEDV病毒下降104，衛(wèi)清寧最大稀釋倍數(shù)為1:1 600時，仍然可以有效殺滅冠狀病毒，與84消毒劑相比較，衛(wèi)清寧是84消毒液效果的16倍。二氯異氰脲酸鈉粉是84消毒劑消毒效果的10倍，這可能與二者有效含氯量有關(guān)，前者有效含氯量為20%，后者有效含氯量為4.5%，而衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合粉）有效含氯量≥10%，除氯制劑起作用外，還與其溶于水后產(chǎn)生氧化性和酸性有關(guān)。

由于新型冠狀病毒COVID-19具有高度傳染性，許多生物實(shí)驗(yàn)室的等級不夠，不能直接進(jìn)行該病毒的研究，但在消毒劑評價時，常可以借用指示消毒效果的替代病毒或指示病毒。在2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中[9-10],規(guī)定可以脊髓灰質(zhì)炎病毒1型疫苗株和艾滋病毒1型美國株懸液定量滅活試驗(yàn)作為指示病毒,來分別代表腸道致病病毒和艾滋病病毒。新型冠狀病毒COVID-19可在Vero-E6細(xì)胞上進(jìn)行增殖[11]。而豬流行性腹瀉PEDV屬于冠狀病毒科[6]，其中ZJ08株是能穩(wěn)定傳代的疫苗株，在Vero-E6細(xì)胞上有明顯特征性細(xì)胞病變，操作簡便，安全且具有良好的穩(wěn)定性，可作為冠狀病毒科新型冠狀病毒的指示病毒。

衛(wèi)清寧主要成分為過硫酸氫鉀復(fù)合粉有效含氯量≥10%，不受有機(jī)物影響，適合不同條件下環(huán)境、水體等消毒，最終代謝產(chǎn)物為氯化鈉和二氧化碳，屬于低毒產(chǎn)品，對環(huán)境及人體無害，且根據(jù)報道，研究人員對過硫酸氫鉀消毒劑產(chǎn)品已做過很多研究，對多種病毒和細(xì)菌孢子等具有殺滅作用，可適用于豬場環(huán)境及人員、水體消毒和家庭日常消毒及泳池水體消毒等，是一種安全高效環(huán)保消毒劑。[12-15]