小菜蛾 PGRP-S2基因的克隆表達(dá)及功能分析

杜少萱，吳 程，蘇月華，楊 梅

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州350100)

昆蟲是世界上種類最多的一個(gè)群體，數(shù)量眾多且分布廣泛(Mayhewetal.,2007)。由于昆蟲自身不存在獲得性免疫系統(tǒng)，所以先天性免疫作為昆蟲抵御病原微生物感染的重要防御系統(tǒng)顯得尤為重要(Kimbrelletal.,2001;Choeetal.,2005)。肽聚糖識(shí)別蛋白PGRPs是昆蟲模式識(shí)別受體中至關(guān)重要的一種病原識(shí)別蛋白，在昆蟲的先天免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。

PGRPs在結(jié)構(gòu)上存在一個(gè)能與肽聚糖(peptidoglycan,PGN)結(jié)合的PGRP結(jié)構(gòu)域，約由165個(gè)氨基酸構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域在無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物中都具有高度的保守性。PGRP結(jié)構(gòu)域與噬菌體T7的溶菌酶高度同源(Liepinshetal.,2003)，噬菌體T7溶菌酶具有裂解PGN的酰胺酶活性，因此有些病原微生物能夠被PGRPs直接殺死并清除(Werneretal.,2000;Liuetal.,2001;Dziarskietal.,2006)。根據(jù)肽聚糖識(shí)別蛋白分子量的大小，可以將已知昆蟲PGRPs蛋白分為2種形式，即長(zhǎng)型(L型)跟短型(S型)，一般短型的PGRPs分子量大約在20～25 kDa，而長(zhǎng)型的PGRPs分子量一般大于90 kDa(Guanetal.,2005;Dziarskietal.,2006)。研究表明大多數(shù)的S型 PGRPs主要在脂肪體內(nèi)合成，而大多數(shù)L型PGRPs在血細(xì)胞中有著較高的表達(dá)量(Dimopoulosetal.,2002)。根據(jù)PGRPs有無酰胺酶活性又可將PGRPs分為有酰胺酶活性的PGRPs和無酰胺酶活性的PGRPs兩種類型(Christophidesetal.,2002;Dziarskietal.,2003)。具有酰胺酶活性的PGRPs能斷開細(xì)菌肽聚糖中肽橋-酰胺鍵，使肽聚糖裂解，而失去免疫活性，導(dǎo)致IMD通路信號(hào)下調(diào)(Zaidmanrémyetal.,2011)。有些PGRPs因缺少酰胺酶活性中所必須的位點(diǎn)，而無酰胺酶活性，使其不能裂解肽聚糖，但是這種類型的PGRPs仍然可以在免疫反應(yīng)中作為受體發(fā)揮作用，譬如在果蠅Drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn)的PGRP-SA蛋白和PGRP-SD蛋白雖然沒有酰胺酶活性，卻可以使作為受體激活Toll信號(hào)通路(Zaidmanrémyetal.,2006;Leoneetal.,2008)。隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，目前已在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、半翅目等多類昆蟲中鑒定到大量的PGRP基因(Mellrothetal.,2003;Guanetal.,2005;Dziarskietal.,2006;Hashimotoetal.,2007;Tanakaetal.,2008;Werneretal.,2008;Sumathipalaetal.,2010;Khajuriaetal.,2011;Kangetal.,2014;Jieetal.,2015)。

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella屬于鱗翅目Lepidoptera菜蛾科Plutellidae，是一種主要危害白菜、蘿卜等十字花科植物的世界性遷飛害蟲，每年用于防控小菜蛾的費(fèi)用高達(dá)40～50億美元(Furlongetal.,2013)。近年來基于免疫系統(tǒng)進(jìn)行生物防治的概念逐漸被提出，因此研究小菜蛾的免疫防御反應(yīng)對(duì)未來進(jìn)行生物防控具有重要的意義。肽聚糖識(shí)別蛋白是一種高度保守的病原識(shí)別蛋白，在小菜蛾抵抗病原微生物的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了小菜蛾P(guān)GRP-S2基因，以原核表達(dá)的方式獲得了重組蛋白，并探究了重組蛋白與大腸桿菌E.coli和金黃色葡萄球菌S.aureus之間的相互作用，用來了解小菜蛾P(guān)GRP-S2在細(xì)菌侵染過程中的潛在功能，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究小菜蛾的天然免疫系統(tǒng)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小菜蛾

小菜蛾品系采集自福建省福州市閩侯縣南通鎮(zhèn)。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)以及金黃色葡萄球菌S.aureus由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購自TaKaRa公司；pET28a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 供試試劑

Eastep? Super總RNA提取試劑盒、Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System DNA 膠回收試劑盒、DNA限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI購自Promega公司；ExTaq酶、250 bp DNA Marker、RACE反轉(zhuǎn)試劑盒SMARTer?RACE 5′/3′ Kit Components、T4 DNA 連接酶購自TaKaRa公司。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

取成蟲形態(tài)的小菜蛾樣品5頭，按Eastep? Super總RNA提取試劑盒提取總RNA。紫外微量分光光度計(jì)及1.0 %凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及完整性。以提取的總RNA為模板，利用SMARTer? RACE 5′/3′ Kit Components試劑盒合成5′-cDNA與3′-cDNA，于-20℃保存。

1.5 5′-RACE與3′-RACE擴(kuò)增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小菜蛾肽聚糖識(shí)別蛋白轉(zhuǎn)錄組序列(NCBI Reference Sequence：XM_011562450.1)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)5′-RACE與3′-RACE特異性引物(表1)。以1.4節(jié)中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用ExTaq酶進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10 ×ExTaqbuffer 1.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，UPM 0.5 μL，引物10.5 μL，5′-RACE cDNA/3′-RACE cDNA 1.0 μL，ExTaq酶0.15 μL，ddH2O 10.9 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第2 輪PCR反應(yīng)的模板，UPS和引物2為擴(kuò)增引物，進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)正確后，回收純化，并送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行拼接。

表1 PCR引物Table 1 Primers for PCR

1.6 小菜蛾 PGRP-S2基因生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析PGRP-S2的開放閱讀框。利用CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)預(yù)測(cè)PGRP-S2的保守結(jié)構(gòu)域；利用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)PGRP-S2蛋白的理化性質(zhì)；利用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè) PGRP-S2蛋白的親疏水性；利用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè) PGRP-S2蛋白是否存在信號(hào)肽；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè) PGRP-S2蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)；利用ClustalX 2.0和MEGA 5.0 (Xie HYetal.,2017)進(jìn)行序列比對(duì)分析和進(jìn)化樹構(gòu)建(NJ法，1000次重復(fù))。

1.7 小菜蛾 PGRP-S2基因的原核表達(dá)與純化

根據(jù)對(duì)序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果，結(jié)合表達(dá)載體pET28a酶切位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物。在上游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)，引物見表1。PCR擴(kuò)增獲得目的基因并連接到pMD19-T載體上，用BamHI酶和EcoRI酶對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-PGRP-S2和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-PGRP-S2。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，以空載的pET28a作為對(duì)照，接種單克隆菌株到含100 mg/mL kana的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、230 rpm過夜搖菌；次日按照1%的接種量接種于含100 mg/mL kana的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、230 rpm發(fā)酵至OD為0.6～0.9；向發(fā)酵液中加入1 mol/L的IPTG 30 μL，使IPTG的終濃度為0.6 mmol/L，18℃、150 rpm誘導(dǎo)24 h使目的蛋白表達(dá)，以未加IPTG誘導(dǎo)作為對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體進(jìn)行超聲破碎，再次離心分別收集細(xì)胞破碎沉淀和上清液。12% SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)結(jié)果。使用AKTA蛋白純化儀對(duì)目的蛋白進(jìn)行Ni柱親和層析純化，利用HiTrapTMDesating脫鹽柱將蛋白純化緩沖液更換為Tris緩沖液以除去咪唑。

1.8小菜蛾 PGRP-S2蛋白功能驗(yàn)證

取金黃色葡萄球菌(G+)與大腸桿菌BL21(DE3)(G-)劃線活化，挑取活化后的單菌落過夜培養(yǎng)，次日按1%的接種量加到30 mL LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵至 OD600為0.5，取1 mL發(fā)酵液離心收集沉淀，用Tris緩沖液洗滌3次，最后用1 mL Tris緩沖液懸浮菌體，備用。

1.8.1重組蛋白的凝集試驗(yàn)

將供試菌懸液稀釋至原濃度的10-5倍，在1.5 mL離心管中建立如下反應(yīng)體系：

表2 反應(yīng)體系Table 2 The reaction system

加樣混勻，放置于搖床中37℃、150 rpm孵育3 h后，在倒置顯微鏡下觀察菌體的分布情況。

1.8.2重組蛋白的抑菌試驗(yàn)

配制如表2所示的反應(yīng)體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)組中的PGRP蛋白液設(shè)置濃度梯度(0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)，放置于搖床中37℃、150 rpm孵育3 h后，取70 μL反應(yīng)液均勻涂布于LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，次日觀察菌落的生長(zhǎng)情況，每組3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小菜蛾5′-RACE與3′-RACE擴(kuò)增

經(jīng)過兩輪的PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5′端和3′端各出現(xiàn)一條特異性條帶，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相同(圖1)。

圖1 RACE PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR product of RACE注:M，250 bp DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，5′-RACE PCR產(chǎn)物；2，3′-RACE PCR產(chǎn)物。Note:M，250 bp DNA marker；1，PCR product of 5′-RACE；2，PCR product of 3′-RACE.

2.2 小菜蛾P(guān)GRP基因克隆及序列分析

對(duì)5′端和3′端的特異性條帶進(jìn)行回收測(cè)序，并用SeqMan進(jìn)行序列拼接。結(jié)果成功克隆了小菜蛾P(guān)GRP基因(圖2)，命名為PGRP-S2(GenBank:MG570190)，該序列的ORF全長(zhǎng)為588 bp，編碼195個(gè)氨基酸。CDD結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該序列含有典型的PGRP超家族保守結(jié)構(gòu)域跟酰胺酶結(jié)構(gòu)域(圖3)。Protparam分析結(jié)果表明其編碼的蛋白質(zhì)理論相對(duì)分子質(zhì)量為21.46 kDa，理論等電點(diǎn)pI為8.46。該蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)為27.90，表明該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，平均親水性(GRAVY)為-0.075，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)。Protscale分析結(jié)果表明該蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)，該結(jié)果與Protparam分析的結(jié)果一致。SignalP 4.1分析結(jié)果表明該蛋白N端存在一個(gè)由第1～21位氨基酸組成的信號(hào)肽。TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.3 小菜蛾 PGRP-S2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

將PGRP-S2編碼的氨基酸序列與與已知功能的鱗翅目昆蟲如棉鈴蟲和柞蠶等的PGRP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖4)，結(jié)果顯示，小菜蛾P(guān)xPGRP-S2中酰胺酶活性所必須的位點(diǎn)(52Q、161H、167T、169S，用*號(hào)表示)和大多數(shù)昆蟲具有高度同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示(圖5)，小菜蛾的PxPGRP-S2與家蠶的短(S)型肽聚糖識(shí)別蛋白BmPGRP-S1聚在同一分支上，兩者的進(jìn)化距離最近。

圖2 PxPGRP-S2 基因序列及其編碼產(chǎn)物Fig.2 The gene sequence of the PxPGRP-S2 and its deduced amino acid 注：?jiǎn)蜗聞澗€表示信號(hào)肽序列；雙下劃線表示PGRP結(jié)構(gòu)域。Note:The underlined signal indicates the signal peptide sequence;the double underline indicates the the PGRP domain.

圖3 克隆序列編碼產(chǎn)物 PGRP-S2 的保守區(qū)域分析Fig.3 Analysis of conserved domains of the product PGRP-S2 encoded by the cloned sequence

圖4 小菜蛾 PxPGRP-S2 氨基酸序列和其他昆蟲PGRPs氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of PGRP-S2 from Plutella xylostlla with PGRPs from other insects注：*表示小菜蛾 PGRP-S2酰胺酶活性位點(diǎn)，PGRPs來源及GenBanak登錄號(hào)如下：PxPGRPs,小菜蛾；ApPGRPs,柞蠶；BmPGRPs,家蠶；DmPGRPs,果蠅；HaPGRPs,棉鈴蟲；MsPGRPs,煙草天蛾；SlPGRPs,斜紋夜蛾。Note：* indicates the PxPGRP-S2 amidase active site of P.xylostella.The origin of PGRPs and their GenBank accession numbers were as follows:PxPGRPs,Plutella xylostella (PxPGRP-S2:MG570190);ApPGRPs,Antherea pernyi (ApPGRP-A:AME17978.1;ApPGRP-B:AME17979.1;ApPGRP-C:AME17980.2);BmPGRPs,Bombyx mori (BmPGRP-S1:NM_001043371.1;BmPGRP-S2:KF906541.1;BmPGRP-S5:NM_001043393.1);DmPGRPs,Drosophila melanogaster (DmPGRP-SC2:NP_610410.1);HaPGRPs,Helicoverpa armigera (HaPGRP-A:KF954940.1;HaPGRP-C:JX082167.1;HaPGRP-D:KF985962.1);MsPGRPs,Manduca sexta (MsPGRP-1A:AF413068.1;MsPGRP-1B:AF413061.1;MsPGRP-2:GQ293365.1);SlPGRPs,Spodopter litura (SlPGRP:XP_022825445.1)

圖5 小菜蛾 PxPGRP-S2與其它昆蟲肽聚糖識(shí)別蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of PxPGRP-S2 of Plutella xylostella and PGRPs from other different insect species注：PGRPs來源：同圖3。Note:Origin species of PGRPs:The same to Fig.3.

2.4 小菜蛾P(guān)xPGRP-S2原核表達(dá)及純化

重組工程菌BL21(DE3)-pET28a-PGRP-S2，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，高效表達(dá)可溶性蛋白(圖6)，誘導(dǎo)的上清液(圖6第2泳道)相對(duì)于對(duì)照組(圖6第1泳道)在約25 kDa處附近出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期的大小一致。使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行Ni柱親和層析純化，洗脫得到目的蛋白(圖6第6-9泳道)。

圖6 SDS-PAGE 檢測(cè)純化的 PxPGRP-S2 蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified PGRP-S2 protein purification注：M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1，未誘導(dǎo)對(duì)照組；2，破壁上清液；3，穿透液；4-9，20～500 mM咪唑濃度線性梯度洗脫蛋白。Note:M，Protein Marker；1，No induction control；2，Broken supernatant；3，Penetration；4-9，The protein was eluted with a gradient of 20～500 mM imidazole.

2.5 小菜蛾P(guān)xPGRP-S2蛋白功能驗(yàn)證

2.5.1重組蛋白的凝集試驗(yàn)

重組蛋白PxPGRP-S2和兩種細(xì)菌的凝集試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，在孵育3 h后，大腸桿菌對(duì)照組(圖7 A)和金黃色葡萄球菌對(duì)照組(圖7 C)中的菌體均以游離狀態(tài)分布，未發(fā)生凝集現(xiàn)象；經(jīng)過重組蛋白PxPGRP-S2處理后的大腸桿菌(圖7 B)和金黃色葡萄球菌(圖7 D)與對(duì)照組相比發(fā)生了凝集(圖7 B，圖7 D中箭頭標(biāo)注的位置)，提示PxPGRP-S2蛋白對(duì)細(xì)菌具有凝集作用。

2.5.2重組蛋白的抑菌試驗(yàn)

利用重組蛋白PxPGRP-S2對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌效應(yīng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組單菌落均勻分布在培養(yǎng)基上面，沒有連成塊狀，而實(shí)驗(yàn)組因加入重組蛋白PxPGRP-S2后，菌體之間相互凝集在一起，在培養(yǎng)基上形成團(tuán)狀，且隨著重組蛋白濃度的增加，形成的團(tuán)狀越大，表明隨著重組蛋白濃度的增加，更多的菌體凝集在一起。但從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)量上觀察，重組蛋白PxPGRP-S2并沒有起到抑菌效果，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PxPGRP-S2蛋白對(duì)于這2種菌只有凝集作用而無殺菌功能。

3 結(jié)論與討論

在果蠅PGRPs的研究中，目前從果蠅基因組中鑒定出來的13個(gè)肽聚糖識(shí)別蛋白，其中有7個(gè)L型的肽聚糖識(shí)別蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，它們被確認(rèn)為跨膜蛋白(如PGRP-LC)；而多數(shù)S型的肽聚糖識(shí)別蛋白，在它們的氨基酸序列中只有信號(hào)肽而不存在跨膜域，它們可能作為分泌蛋白(Lemaitreetal.,2007)。對(duì)小菜蛾P(guān)GRP-S2序列進(jìn)行信號(hào)肽以及跨膜分析表明該序列編碼的蛋白存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)但不存在跨膜結(jié)構(gòu)，推測(cè)該序列編碼的蛋白屬于分泌型蛋白的可能性較大。

圖7 重組蛋白PxPGRP-S2對(duì)兩種細(xì)菌的凝集反應(yīng)Fig.7 The agglutination of PxPGRP-S2 reconbinant protein with two types of bacteriaA，Escherichia coli/Tris(ZnCl2)；B，E.coli/PxPGRP-S2(ZnCl2)；C，S.aureus/Tris(ZnCl2)；D，S.aureus/PxPGRP-S2(ZnCl2)

基于前期對(duì)PGRPs功能的研究發(fā)現(xiàn)不管是無脊椎動(dòng)物還是脊椎動(dòng)物，能夠使細(xì)菌肽聚糖裂解的PGRP蛋白很可能具有抗菌活性，比如在果蠅中的PGRP-SB1蛋白(Geliusetal.,2003)，以及人類、小鼠還有文昌魚中的PGRP-L蛋白(Wangetal.,2003;Yangetal.,2010;Fengetal.,2012;Lietal.,2012)，這些蛋白在免疫過程中直接作為殺菌因子。果蠅PGRP-SB1蛋白因其具有保守的酰胺酶結(jié)構(gòu)而具有抗菌活性，但并不是所有具有酰胺酶活性結(jié)構(gòu)域的PGRP蛋白都具有殺菌活性，比如果蠅PGRP-SC蛋白也具有保守的酰胺酶結(jié)構(gòu)，但該蛋白就沒有直接的抗菌活性(Mellrothetal.,2006)，同時(shí)羅嫚等人(2016)對(duì)家蠅PGRP-SA蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌結(jié)合，但是并不能直接殺死它們，而是通過與它們結(jié)合并識(shí)別，從而激活Toll信號(hào)通路，引起下游抗菌肽的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾P(guān)xPGRP-S2蛋白能夠介導(dǎo)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌發(fā)生凝集反應(yīng)，但并不具備直接的抗菌活性，表明該蛋白雖然具有酰胺酶結(jié)構(gòu)域，但不具備酰胺酶活性，其作用機(jī)理可能是通過識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌表面的肽聚糖，激活下游信號(hào)通路產(chǎn)生抗菌肽等殺菌物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物的免疫防御。當(dāng)然，對(duì)于該蛋白具體功能和作用機(jī)制的研究還有很長(zhǎng)的路要走，比如該蛋白在小菜蛾體內(nèi)的功能是什么？主要響應(yīng)的是哪一類病原微生物？其介導(dǎo)的下游免疫信號(hào)通路是哪些？具體的機(jī)制如何？這些問題均需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步深入探討。本研究為深入研究該蛋白的體內(nèi)功能提供了必不可少的序列信息、重組蛋白以及初步的功能預(yù)測(cè)。