不同方法對(duì)紅火蟻社會(huì)型鑒定效果的比較

王晨軒，賈羚藝，李天楚，陳 立，黃大衛(wèi),,4*

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002；2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；4.南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300350)

紅火蟻SolenopsisinvictaBuren，膜翅目蟻科，是一種社會(huì)性昆蟲(chóng)，有多個(gè)品級(jí)，包括蟻后、有生殖能力的雌蟻、雄蟻，以及無(wú)生殖能力的工蟻。紅火蟻原產(chǎn)于南美洲，后傳入美國(guó)、澳大利亞、新西蘭，乃至亞洲的諸多國(guó)家和地區(qū)，例如中國(guó)大陸、臺(tái)灣、香港、澳門(mén)、菲律賓、泰國(guó)、馬來(lái)西亞等(董慧和楊定，2005)。該物種擴(kuò)散能力極強(qiáng)，具有很強(qiáng)的攻擊性，是世界上最成功的入侵性螞蟻之一(Tschinkel，2006)，可在農(nóng)業(yè)和林業(yè)的生產(chǎn)、生態(tài)平衡，以及公共安全等方面產(chǎn)生巨大危害(Vinson，2013)。

紅火蟻具有單蟻后(Monogyne)和多蟻后(Polygyne)兩種社會(huì)型，單蟻后型巢穴僅具有一只可繁殖蟻后，多蟻后型巢穴中具有兩只及以上可繁殖蟻后。紅火蟻?zhàn)?004年在中國(guó)大陸被發(fā)現(xiàn)后，疫情嚴(yán)重，傳播廣泛(陸永躍和曾玲，2015)。在紅火蟻傳播過(guò)程中，其社會(huì)型格局可在同一地區(qū)的不同時(shí)間發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，不同地區(qū)間社會(huì)型格局也不相同。不同社會(huì)型的紅火蟻在行為、種群結(jié)構(gòu)、擴(kuò)張速度等方面存在較大差異，因此鑒定社會(huì)型是對(duì)紅火蟻制定有效監(jiān)控方案的關(guān)鍵步驟(邵敬國(guó)等，2008)。

關(guān)于紅火蟻兩種社會(huì)型產(chǎn)生的機(jī)制已有較為深入的研究，紅火蟻已日漸成為研究螞蟻類(lèi)群社會(huì)結(jié)構(gòu)的模式物種。Gp-9基因?qū)t火蟻巢穴中工蟻是否接納蟻后有著很大影響(Ross，1997)。單蟻后在該基因位點(diǎn)是純合子，僅擁有Gp-9B等位基因，而多蟻后型是雜合子，擁有Gp-9B和Gp-9b兩個(gè)等位基因。不同社會(huì)型由Gp-9基因的等位基因決定，b等位基因與紅火蟻多蟻后社會(huì)型有密切關(guān)系(Ross，1998)。對(duì)Gp-9進(jìn)行測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)該基因編碼了一種信息素結(jié)合蛋白，該蛋白與工蟻能否接受純合子蟻后或雜合子蟻后相關(guān)(Ross，2002)。

單蟻后巢穴中，基因型為BB的雌蟻與基因型為BB的雄蟻婚飛交配后，產(chǎn)生后代均為BB型。單蟻后巢穴產(chǎn)生的BB型雌蟻個(gè)體較大，婚飛后能夠獨(dú)立建立新巢，并培育第一代工蟻。多蟻后巢穴中的Bb型蟻后會(huì)產(chǎn)生BB、Bb和bb 3種基因型后代，其中bb型工蟻或蟻后壽命很短；BB型雌蟻體型比單蟻后巢穴中的BB型雌蟻小，短距離婚飛后無(wú)法獨(dú)自建立新巢，最終回歸舊巢或加入其它多蟻后巢穴，但會(huì)逐漸被Bb型工蟻殺死(DeHeer，1999；Huang and Wang，2014)，而B(niǎo)b型蟻后傾向回歸舊巢進(jìn)行繁殖(Krieger，2005)，最終導(dǎo)致Bb基因型占多蟻后型巢穴基因型的90%左右，因此多蟻后型巢顯示雜合子基因型(Ross，1997)。

單蟻后種群與多蟻后種群除蟻后數(shù)目和身體大小不同之外，還有諸多特征表現(xiàn)出明顯差異。多蟻后型蟻巢較小且蟻群密度大，繁殖能力強(qiáng)(Rossetal.，1999)，具有更強(qiáng)的種間競(jìng)爭(zhēng)力(Porteretal.，1988)，因此多蟻后型能夠更好的適應(yīng)入侵環(huán)境，建立新的生態(tài)平衡(Porter and Savignano，1990)。高密度多蟻后型巢穴增加了防治頻次和成本(Greenbergetal.，1992)。雖然已經(jīng)有鑒定紅火蟻種群的社會(huì)型方法報(bào)道，但缺乏一套可重復(fù)性高且操作便捷的標(biāo)準(zhǔn)化鑒定方法。

紅火蟻的巢穴密度、外形及行為等特征可以初步判斷紅火蟻的社會(huì)型。多蟻后型紅火蟻與單蟻后型紅火蟻相比，工蟻體型較小，數(shù)量較多。多蟻后型紅火蟻巢穴之間相鄰較近，蟻巢密度較大。當(dāng)多蟻后型的工蟻遭遇同種個(gè)體的入侵時(shí)，無(wú)論入侵者來(lái)自單蟻后型巢穴，還是來(lái)自于多蟻后型巢穴，都沒(méi)有很強(qiáng)的攻擊性，而單蟻后型的工蟻與之相反，對(duì)同種個(gè)體入侵的防范意識(shí)更強(qiáng)(Fritz and Meer，2003)。依據(jù)這些生物學(xué)特征，可以簡(jiǎn)單的對(duì)紅火蟻的類(lèi)型進(jìn)行區(qū)分，但是生物學(xué)觀(guān)察法容易出現(xiàn)因觀(guān)察不詳細(xì)或小樣本量對(duì)統(tǒng)計(jì)造成的誤差產(chǎn)生判斷錯(cuò)誤。利用PCR(Polymerase Chain Reaction)等分子生物學(xué)手段，能夠達(dá)到更好的鑒定效果。Gp-9基因位于紅火蟻基因組的低重組區(qū)域，通過(guò)對(duì)紅火蟻15種Gp-9基因的比較，發(fā)現(xiàn)該基因在紅火蟻類(lèi)群中十分保守，編碼區(qū)在不同物種間僅涉及點(diǎn)突變的變異(Krieger and Ross，2005)。因此可以通過(guò)對(duì)該基因及附近區(qū)段的DNA序列設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR擴(kuò)增和凝膠電泳等手段驗(yàn)證紅火蟻DNA樣品中是否含有Gp-9等位基因B或b，進(jìn)而判斷紅火蟻種群的社會(huì)型。

基于PCR的鑒定方法，已有大量研究報(bào)道了不同的引物或方法對(duì)紅火蟻社會(huì)型的鑒定效果，受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞(Chenetal.，2006;Goodismanetal.，2007;Laietal.，2008;Yangetal.，2008;Yangetal.，2009;Allenetal.，2010;Garlapatietal.，2010;Laietal.，2010;Linetal.，2010;Chirinoetal.，2012;Laietal.，2012;Yangetal.，2012;Chenetal.，2014;Kelly and Sellers，2014;Laietal.，2015;Kayetal.，2018)。目前已有多種針對(duì)Gp-9序列設(shè)計(jì)的引物，可以通過(guò)PCR對(duì)紅火蟻的Gp-9基因型進(jìn)行鑒定。本文以中國(guó)紅火蟻為材料，選取7對(duì)不同的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)比不同種類(lèi)的DNA聚合酶在實(shí)驗(yàn)中的擴(kuò)增效果，從而比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)度，篩選出了一套便捷可靠的實(shí)驗(yàn)方案，為鑒定紅火蟻社會(huì)型提供了技術(shù)參考，以期為紅火蟻的相關(guān)研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 樣本采集及生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)量

實(shí)驗(yàn)所用紅火蟻于2018年7月和9月采集于廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園和廣州市黃埔區(qū)廣州科學(xué)城。觀(guān)察蟻巢大小及密度后掘土采集螞蟻，待蟻群穩(wěn)定后使用“滴水浸泡法”將蟻群從土壤中逼出，轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)盒中，飼養(yǎng)盒為60 cm×44 cm×36 cm的塑料整理箱，整理箱四壁涂有Fluon以防止蟻群逃逸，溫度26℃，濕度60%～70%并提供水、蜂蜜水和黃粉蟲(chóng)在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。對(duì)各巢螞蟻進(jìn)行生物學(xué)觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)每巢中脫翅蟻后的數(shù)量。

1.2 基因組DNA提取

本實(shí)驗(yàn)共采用來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園和廣州科學(xué)城不同區(qū)域的8巢紅火蟻，每巢分別隨機(jī)收集25頭工蟻，使用EasyPure Genomic DNA Kit (TransGen Biotech,Beijing,China)提取基因組DNA，使用NanoDrop-2000 Spectrophotometer (Thermo,Madison,WI,USA)測(cè)量DNA濃度和純度。最終保證使用的DNA濃度大于100 μg/μL，OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8～2.0。

1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

由于不同引物所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同、引物的退火溫度不同，所以本研究中針對(duì)不同的引物，采取不同的PCR程序(表1)。此外，為對(duì)比不同DNA聚合酶的擴(kuò)增效果，對(duì)編號(hào)為7和8的紅火蟻樣品，針對(duì)相同的引物(多重PCR技術(shù)的引物，表1)使用不同的DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。共選取4種DNA聚合酶(表2)：(1)兩種不同廠(chǎng)家的熱啟動(dòng)高保真酶：Platinum? Taq DNA polymerase (Invitrogen,Carlsbad,USA)，TransStart? Taq DNA Polymerase (TransGen Biotech,Beijing,China)。(2)兩種不同廠(chǎng)家的高保真酶：TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity (TransGen Biotech,Beijing,China)，KOD DNA Polymerase (Toyobo,Osaka,Japan)。

1.4 凝膠電泳檢測(cè)及限制性?xún)?nèi)切酶檢測(cè)

PCR產(chǎn)物使用1%凝膠電泳檢測(cè)后，選擇單蟻后型和多蟻后型PCR產(chǎn)物使用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII (NEB,Beijing,China)，按照使用說(shuō)明進(jìn)行酶切，檢測(cè)條帶大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅火蟻的生物學(xué)觀(guān)察

通過(guò)一定時(shí)間的觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)8號(hào)紅火蟻巢中工蟻體型較大，且僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)脫翅蟻后。編號(hào)1-7巢中可發(fā)現(xiàn)兩個(gè)及以上脫翅蟻后，編號(hào)1-7較編號(hào)8巢中工蟻體型小。因此通過(guò)形態(tài)特征鑒定推測(cè)蟻巢8中的紅火蟻為單蟻后型，其他7巢為多蟻后型。

2.2 不同引物擴(kuò)增紅火蟻 Gp-9 基因的結(jié)果

以紅火蟻DNA為模板，用7對(duì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)(圖1)可見(jiàn)多重PCR技術(shù)(圖1A)條帶清晰，單蟻后型與多蟻后型結(jié)果區(qū)別明顯，重復(fù)性較高(成功率0.86，n=7)。對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切之后(圖1B)，多蟻后型顯示兩條大小不一的條帶，單蟻后型帶型不發(fā)生改變。針對(duì)b等位基因的一種方法(圖1C，D)可在多蟻后型樣品中擴(kuò)增出單一條帶(分別為219 bp 和259 bp)，單蟻后型無(wú)條帶，重復(fù)性較高(成功率1.00，n=7)。對(duì)2013年報(bào)道的4對(duì)同時(shí)擴(kuò)增B、b等位基因的引物(Wangetal.，2013)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖1E-H)，發(fā)現(xiàn)4對(duì)引物的成功率均較低，或擴(kuò)增條帶不清晰，容易出現(xiàn)雜帶，對(duì)實(shí)驗(yàn)判斷造成影響。其中圖1G對(duì)應(yīng)的引物，雖然可獲得清晰條帶，但是重復(fù)性較低(成功率0.43，n=7)。

表1 引物及其程序設(shè)定Table 1 Primers and PCR program settings

表2 DNA聚合酶Table 2 DNA polymerases

圖1 應(yīng)用 Gp-9等位基因檢測(cè)紅火蟻的社會(huì)型Fig.1 Gp-9 banding patterns of social forms of Solenopsis invicta注：實(shí)驗(yàn)中各引物PCR擴(kuò)增結(jié)果及條帶大小見(jiàn)電泳圖；M，DNA Marker；1,2,3,4,5,6,7,8蟻巢編號(hào)；A，多重PCR技術(shù)；B，對(duì) Gp-9B-specific 26BS 16BAS，Gp-9b-specific:24bS 25bAS引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定；C，D，Gp-9b 等位基因擴(kuò)增法；E-H，其他同時(shí)擴(kuò)增B、b等位基因的引物；所使用的DNA聚合酶均為Invitrogen公司生產(chǎn)的熱啟動(dòng)酶Platinum? Taq DNA polymerase。Note:PCR amplification of each pair of primer in the experiment and their sizes were shown in electrophoresis.M,DNA Marker;1,2,3,4,5,6,7,8 Nest numbers;A,Multiplex PCR,B,Enzyme digestion of PCR amplification products of Gp-9B-specific 26BS 16BAS and Gp-9b-specific 24bS 25bAS primers;C,D,Gp-9b allele amplification;E-H,other primers that simultaneous amplification of B and b alleles;All the PCR were conducted using Platinum? Taq DNA polymerase,Invitrogen.

2.3 不同DNA聚合酶擴(kuò)增紅火蟻 Gp-9基因的結(jié)果

以?xún)沙布t火蟻的DNA為模板，使用相同引物(多重PCR技術(shù)的引物Gp-9B-specific:26BS 16BAS，Gp-9b-specific:24bS 25bAS)，在相同的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序(表1)下，分別用4種不同的DNA聚合酶(表2)進(jìn)行擴(kuò)增，以對(duì)比不同DNA聚合酶在驗(yàn)證紅火蟻社會(huì)型PCR實(shí)驗(yàn)中的效果。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4種酶的擴(kuò)增效果具有明顯差別：高保真酶TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)可檢出的電泳條帶(圖2A)；熱啟動(dòng)酶Platinum? Taq DNA polymerase擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于其他酶，基本沒(méi)有引物二聚體產(chǎn)生，電泳帶型易于區(qū)分單蟻后多蟻后，單蟻后型為單一條帶，多蟻后型為兩條條帶(圖2B)；熱啟動(dòng)酶TransStart? Taq DNA Polymerase擴(kuò)增產(chǎn)物中有非特異擴(kuò)增的雜帶(圖2C)；KOD DNA Polymerase酶擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶較亮，說(shuō)明產(chǎn)物的DNA量較高，此外條帶較寬，無(wú)法區(qū)分相鄰帶型，且條帶大小與預(yù)期不符，說(shuō)明有大量非特異擴(kuò)增(圖2D)。由此可見(jiàn)，所對(duì)比的4種DNA聚合酶中，熱啟動(dòng)酶Platinum? Taq DNA polymerase最為適用。

圖2 利用多重PCR技術(shù)引物和使用不同DNA聚合酶對(duì)兩種社會(huì)型紅火蟻的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Identification of two different social forms of Solenopsis invicta Buren by Multiplex PCR using different DNA polymerases.注：M，DNA Marker；7和8，蟻巢編號(hào)，分別為多蟻后型和單蟻后型；圖A，用酶TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity擴(kuò)增結(jié)果；圖B，用酶Platinum? Taq DNA polymerase擴(kuò)增結(jié)果；圖C，用酶TransStart? Taq DNA Polymerase擴(kuò)增結(jié)果；圖D，用酶KOD DNA Polymerase擴(kuò)增結(jié)果。Note:M,DNA Marker;7 and 8,nest Numbers,polygyne and monogyne respectively;A,results of PCR using TransTaq DNA Polymerase High Fidelity;B,results of PCR using Platinum? Taq DNA polymerase;C,results of PCR using TransStart Taq DNA Polymerase;D,results of PCR using KOD DNA Polymerase.

3 結(jié)論與討論

自紅火蟻社會(huì)型分化的調(diào)控機(jī)制報(bào)道以來(lái)，針對(duì)Gp-9位點(diǎn)的PCR分子鑒定手段有很多。本研究基于這一背景進(jìn)行了各種方法之間的比較，選取了7對(duì)具有代表性的引物以及4種DNA聚合酶進(jìn)行對(duì)比，并最終獲得了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)鑒定紅火蟻社會(huì)型的最佳實(shí)驗(yàn)方案。

通過(guò)比較7對(duì)引物的實(shí)驗(yàn)可行性及重復(fù)性，本研究發(fā)現(xiàn)其中4對(duì)同時(shí)擴(kuò)增B、b等位基因的引物因重復(fù)性較差或擴(kuò)增條帶特異性不高(圖1E-H)，不利于紅火蟻社會(huì)型的實(shí)驗(yàn)鑒定。而多重PCR技術(shù)與Gp-9b等位基因擴(kuò)增(圖1A-D)的準(zhǔn)確率較高，重復(fù)性較強(qiáng)。在多重PCR技術(shù)最早的報(bào)道中，Valles and Porter (2003)提出可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，從而更易辨別單蟻后型和多蟻后型的條帶。在本研究的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)該方法的PCR步驟可同時(shí)擴(kuò)增出大小不一的條帶，分別對(duì)應(yīng)多蟻后型和多蟻后型。其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后已經(jīng)可以清晰的展現(xiàn)不同條帶大小的區(qū)別(圖1A)，無(wú)需后續(xù)的酶切步驟(圖1B)即可用于判斷樣品的社會(huì)型。而Gp-9b等位基因擴(kuò)增的兩種引物(圖1C，D)只能擴(kuò)增出b等位基因的單一條帶，對(duì)B等位基因無(wú)擴(kuò)增效力，是針對(duì)b等位基因的特異引物。因此可以將Gp-9b等位基因擴(kuò)增與多重PCR技術(shù)搭配使用，二者的電泳結(jié)果可相互印證，共同判別紅火蟻的社會(huì)型。

在對(duì)不同酶的對(duì)比中，本研究所選的4種聚合酶均具有不同強(qiáng)度的保真性，并且這4種酶中還包括兩種熱啟動(dòng)酶。酶的高保真性主要可以通過(guò)兩種手段實(shí)現(xiàn)，一種是利用某些特殊的DNA聚合酶本身的保真性，另一種是將普通DNA聚合酶與具有外切酶活性的其他酶按不同比例混合。因此不同品牌的不同高保真DNA聚合酶產(chǎn)品，其保真效率也不盡相同。在本研究所對(duì)比的4種DNA聚合酶中，四者均具有高保真功能。其中高保真酶TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity同時(shí)具有5′ → 3′的外切酶活性和3′ → 5′的外切酶活性，保真效果最好，錯(cuò)配率最低，用該酶進(jìn)行紅火蟻社會(huì)型的PCR鑒定，沒(méi)有擴(kuò)增出預(yù)期條帶。引物序列與待測(cè)樣品的序列結(jié)合并非完全一致，不能滿(mǎn)足此類(lèi)高保真DNA聚合酶的擴(kuò)增條件。另外，KOD DNA Polymerase酶使用了自然菌株(超嗜熱原始菌ThermococcuskodakaraensisKOD1株)的DNA聚合酶，該酶具有天然的3′ → 5′的外切酶活性，但活性較其他混合高保真酶類(lèi)更弱，因此非特異擴(kuò)增產(chǎn)物較多，不適用于紅火蟻的社會(huì)型鑒定。

而熱啟動(dòng)DNA聚合酶的工作原理主要是通過(guò)對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾、加入酶抗體或其他特異蛋白等手段，減少低溫下DNA聚合酶發(fā)生鏈錯(cuò)配或產(chǎn)生引物二聚體。本研究所對(duì)比的4種DNA聚合酶中，有兩種具有熱啟動(dòng)功能，其中熱啟動(dòng)酶Platinum?Taq DNA polymerase擴(kuò)增效果優(yōu)于熱啟動(dòng)酶TransStart?Taq DNA Polymerase，其原因可能來(lái)自各個(gè)方面，例如保真酶的成分和比例、熱啟動(dòng)的原理不同等等。而與其他3種酶比較，Platinum?Taq DNA polymerase的效果也為最佳，這可能與其適中的保真性和較強(qiáng)的熱啟動(dòng)功能有關(guān)，該酶在對(duì)紅火蟻社會(huì)型的PCR鑒定中較為適用。

針對(duì)本研究所采集的8個(gè)蟻巢，生物學(xué)形態(tài)鑒定結(jié)果中僅編號(hào)8巢有單只脫翅蟻后，Gp-9b等位基因擴(kuò)增和多重PCR技術(shù)所獲得的鑒定結(jié)果與生物學(xué)觀(guān)察所得結(jié)果相互驗(yàn)證，彌補(bǔ)了生物學(xué)觀(guān)察所帶來(lái)的缺陷，最終表明1-7號(hào)巢為多蟻后型巢穴，而只有8號(hào)巢穴為單蟻后型。這表明Gp-9b等位基因擴(kuò)增和多重PCR技術(shù)的分子鑒定結(jié)果十分可靠，且重復(fù)率高，可以與生物學(xué)觀(guān)察一同用于判定紅火蟻的社會(huì)型。

除了本研究所采用的基于PCR的分子鑒定法外，紅火蟻的社會(huì)型的判斷還有其他方法，例如蛋白質(zhì)電泳法、探針?lè)ǖ?。蛋白質(zhì)電泳法(DeHeer，1999)利用Gp-9B蛋白與Gp-9b蛋白的遷移速率不同這一原理，根據(jù)蛋白電泳條帶判斷Gp-9的基因型，從而判斷紅火蟻的社會(huì)型。但是蛋白質(zhì)電泳對(duì)提取樣品有較高的要求，必須采集活體螞蟻且每個(gè)樣本所需螞蟻數(shù)目較大，加之蛋白質(zhì)電泳技術(shù)本身的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，因此此方法并不適于快速鑒定紅火蟻社會(huì)型。探針?lè)ɡ门cGp-9基因結(jié)合的引物和探針檢測(cè)Gp-9基因型(Ascunceetal.，2010)，有較高的靈敏度，但該方法所需探針較為昂貴，且實(shí)驗(yàn)流程繁瑣，需配備熒光定量PCR儀，不適合在所有實(shí)驗(yàn)室普及。

此外還有多種PCR與其他實(shí)驗(yàn)手段相結(jié)合的方法，例如RFLP法(Restriction Fragment Length Polymorphism) (Lucasetal.，2015)，該方法需設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR，且擴(kuò)增片段較長(zhǎng)(2 kb)，增加了實(shí)驗(yàn)的難度，此外RFLP操作繁瑣,不適于快速檢測(cè)紅火蟻社會(huì)型。而HRM(高分辨率熔解曲線(xiàn))法需要借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR完成實(shí)驗(yàn)(Oakeyetal.，2011)，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)于復(fù)雜。此外還有人提出可以利用紅火蟻cDNA擴(kuò)增Gp-9序列，但該方法需要進(jìn)行紅火蟻RNA的提取和cDNA的逆轉(zhuǎn)錄(Leal and Ishida，2008)，增加實(shí)驗(yàn)步驟。

由此可見(jiàn)，上述不同方法因?yàn)閷?shí)驗(yàn)步驟繁瑣、成本較高，或需要特殊的實(shí)驗(yàn)儀器等原因并不適用于所有實(shí)驗(yàn)室。與其對(duì)比之下，本研究篩選出的多重PCR技術(shù)與Gp-9b等位基因擴(kuò)增相結(jié)合的PCR鑒定方案對(duì)螞蟻樣品的要求較低，只需使用酒精浸泡的工蟻樣本，就可通過(guò)簡(jiǎn)單的DNA提取步驟獲得實(shí)驗(yàn)所需DNA樣品。此外，基于PCR的技術(shù)簡(jiǎn)單易行，具備常規(guī)分子生物學(xué)器材配備的實(shí)驗(yàn)室均能操作，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短，通?？稍?～3 h內(nèi)批量完成多個(gè)不同巢穴的鑒定試驗(yàn)，更適用于普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)紅火蟻社會(huì)型的鑒定。

綜上所述，本文提出一套針對(duì)紅火蟻社會(huì)型鑒定的組合方案——將多重PCR技術(shù)，Gp-9b等位基因擴(kuò)增這兩種分子生物學(xué)方法相結(jié)合，利用具有中等保真性能和較強(qiáng)熱啟動(dòng)效率的DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并輔以生物學(xué)觀(guān)察的手段進(jìn)行鑒定，通過(guò)這三者實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相互驗(yàn)證，能更好的判斷中國(guó)紅火蟻種群的社會(huì)型。