哺乳動物細(xì)胞中糖鏈結(jié)構(gòu)的改造

金則成， 喜多島敏彥， 藤田盛久， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

生物藥物分子是一類由生物體包括細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物。 藥物蛋白質(zhì)如單克隆抗體具有高特異性和與靶分子的高親和性， 同時與傳統(tǒng)藥物相比具有更低的副作用。目前，重組藥物蛋白質(zhì)已經(jīng)在治療疑難雜癥如癌癥和自身免疫疾病方面變得越來越重要[1-3]。 目前，大部分藥物蛋白質(zhì)主要由哺乳動物細(xì)胞合成，這主要是由于哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)可以提升正確折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和促進(jìn)翻譯后蛋白質(zhì)的折疊[4-5]。 由于大多數(shù)分泌蛋白質(zhì)具有糖鏈，為了維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能以及抵御免疫反應(yīng)，適當(dāng)?shù)奶擎準(zhǔn)欠浅１匾摹?/p>

使用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)生物藥物分子依然有幾個缺點(diǎn)，包括高成本和糖鏈的不均一性。 為了確保用作為生物藥物分子的蛋白質(zhì)質(zhì)量和穩(wěn)定性，糖鏈的不均一性是一個必須要解決的問題。 舉例來說，紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）之類的細(xì)胞因子在體外必須具有含唾液酸的復(fù)合型糖鏈才具有活性[6-9]。 同時，對蛋白質(zhì)的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造可以提高蛋白質(zhì)的功能活性。 舉例來說，具有移除巖藻糖結(jié)構(gòu)的N-糖鏈的抗體可以大幅提高抗體依賴性的細(xì)胞毒性（ADCC）作用[10-11]。 現(xiàn)在，為了生產(chǎn)抗體，不進(jìn)行巖藻糖修飾的細(xì)胞已經(jīng)被頻繁地使用。 可以生產(chǎn)均一的糖蛋白的哺乳動物細(xì)胞株的構(gòu)建是目前生物醫(yī)藥品生產(chǎn)領(lǐng)域中最迫切的需求。

圖1 展示了糖鏈在哺乳動物細(xì)胞中的合成途徑，糖蛋白首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中，蛋白質(zhì)上的糖鏈在α-1，2 甘露糖苷酶的催化下轉(zhuǎn)變成Man5-GlcNAc2 型結(jié)構(gòu)的糖鏈。 目前獲得Man5-GlcNAc2 型結(jié)構(gòu)的糖鏈主要有兩種方法：一種是利用N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I（GnT-I）編碼基因MAGT1 的突變或敲除細(xì)胞生成， 然而這種方法的缺點(diǎn)是該細(xì)胞株不能產(chǎn)生Man9-GlcNAc2或Man8-GlcNAc2 型結(jié)構(gòu)的糖鏈；另外一種方法就是通過化學(xué)試劑幾夫堿（kifunensine)或脫氧野尻霉素（deoxynojirimycin)抑制細(xì)胞α-1，2 甘露糖苷酶的活性，缺點(diǎn)是如果想要獲得穩(wěn)定均一的糖型，需要用化學(xué)試劑持續(xù)處理細(xì)胞。

溶酶體中含有多種水解酶，這些水解酶大部分是帶有糖鏈的糖蛋白，它們可以將蛋白質(zhì)、粘多糖、糖脂等物質(zhì)消化為小分子，提供細(xì)胞再次回收利用[13]。這些水解酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，在高爾基體內(nèi)進(jìn)行糖鏈的修飾，然后通過特定的M6PR 受體的識別被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中。 高爾基體中糖鏈的修飾往往是通過在核心糖鏈的Man 的6 位上添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸酯部分（GlcNAc-1-P），產(chǎn)生Man-6-P-1-GlcNAc，然后將GlcNAc 的部分除去， 形成具有酸性糖鏈的糖蛋白，然后通過特定的M6PR 受體的識別被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中[14-16]。

圖1 哺乳動物細(xì)胞N-糖鏈合成途徑Fig.1 Pathway of N-glycan synthesize in mammalian cells

當(dāng)產(chǎn)生的水解酶因?yàn)榇x通路異常無法正常運(yùn)送至溶酶體或者是因控制該溶酶體酶的基因發(fā)生突變，該酶反應(yīng)鏈中的中間產(chǎn)物不能正常降解而在溶酶體中貯積，從而引起細(xì)胞組織器官功能的障礙，導(dǎo)致溶酶體貯積癥的發(fā)生[17-18]。 例如，法布萊病的病人由于缺少α 半乳糖苷酶，使得糖脂特別是一種中間產(chǎn)物globortriaosylceramide（Gb3）無法被分解而蓄積在細(xì)胞的溶酶體中， 從而威脅著他們的生命。 目前對于溶酶體貯積癥主要的療法有：酶替代療法、化學(xué)療法、基因水平上的基因修飾療法等，而其中最為經(jīng)典的方法即為酶替代療法。 由于細(xì)胞膜表面存在M6PR，M6PR 可以識別藥物蛋白質(zhì)上的糖鏈結(jié)構(gòu)并將蛋白質(zhì)帶到溶酶體， 從而能夠通過M6PR 用正常的水解酶替代自身損傷的水解酶，使溶酶體貯積癥得到改善[19-20]。

因糖鏈的不均一性而導(dǎo)致的糖蛋白的不均一性會對糖蛋白的生產(chǎn)及其應(yīng)用產(chǎn)生不良影響。 由于M6PR 對于糖蛋白具有專一識別性， 當(dāng)糖蛋白中存在部分糖鏈結(jié)構(gòu)并非高甘露糖型或者說不存在6位被磷酸化的糖鏈時，會導(dǎo)致M6PR 對于藥物的吸收效率的降低，導(dǎo)致治療效率不高[21-22]。 另外，當(dāng)糖鏈存在不均一的情況時，因?yàn)樘擎湹慕Y(jié)構(gòu)還可能導(dǎo)致糖蛋白被機(jī)體識別為外來的抗原物質(zhì)，從而引起免疫反應(yīng)。 出于藥物分子的安全性的考慮，需要盡量確保糖鏈的均一性。

本研究可提供一種可用于生產(chǎn)均一性藥物糖蛋白的細(xì)胞株， 即敲除MAN1A1 和MAN1A2 的雙敲除細(xì)胞株Double-KO 細(xì)胞株。該細(xì)胞株中高甘露糖型N-糖鏈所占比例增加，同時由于復(fù)合型N-糖鏈的下降也可以證明該細(xì)胞株內(nèi)糖鏈的表現(xiàn)形式更均一。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人體胚胎腎細(xì)胞HEK293 使用10%胎牛血清（FCS） 的DMEM 培養(yǎng)基 （Gibco，Life technologies，USA）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%。

1.2 高爾基體α-甘露糖苷酶的基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

利 用 CRISPR -Cas9 （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術(shù)[23]敲除基因往往需要設(shè)計一個20 bp 長度的序列片段， 且該序列片段后要有一個PAM 位點(diǎn)（NGG/NAG）。 在本實(shí)驗(yàn)中，需要敲除的兩個基因MAN1A1/MAN1A2 的基因序列從NCBI 上下載得到。 關(guān)于guide-RNA 的設(shè)計， 在Michael Boutros lab's Target Finder（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html） 上找到敲除基因所需的guide-RNA 的DNA 序列。 通過網(wǎng)站設(shè)計可以獲得MAN1A1 的兩條靶序列及各自所使用的引物序列為：

MAN1A1KO1：AAAACCACGAGCGGGCTCTCAGG PrimerKO1F：caccAAAACCACGAGCGGGCTCTC PrimerKO1R：aaacGAGAGCCCGCTCGTGGTTTT MAN1A1KO2：CCACCTTCTTCTTCTCCAGTAGG primerKO2F：caccCCACCTTCTTCTTCTCCAGT

primerKO2R：aaacACTGGAGAAGAAGAAGGTGG MAN1A2 的兩條靶序列及各自所使用的引物序列為：

MAN1A2KO1：CCTTTACCGGCATCTACATGTGG rimerKO1F：caccCCTTTACCGGCATCTACATG rimerKO1R：aaacCATGTAGATGCCGGTAAAGG AN1A2KO2：CATGGATCAGGAAGACTCCGGGG rimerKO2F：caccCATGGATCAGGAAGACTCCG rimerKO2R：aaacCGGAGTCTTCCTGATCCATG。如圖2 所示，將含有CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的質(zhì)粒pX330-EGFP 使用Bbs1（NEB：R0539S）切開，并使用Mighty Mix 將設(shè)計好的靶序列與質(zhì)粒上guide-RNA 的DNA 序列序列相連接， 構(gòu)建為含有MAN1A1/MAN1A2 靶點(diǎn)的質(zhì)粒， 并將它們命名為：pX330 -EGFP -MAN1A1KO1/pX330 -EGFP -MAN1A1KO2、pX330-EGFP-MAN1A2KO1/ pX330-EGFP-MAN1A2KO2。

圖2 CRISPR/Cas9 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of CRISPR/Cas9 KO plasmid

1.3 轉(zhuǎn)染

將野生型細(xì)胞HEK293 使用10%FCS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜， 待其生長到約90%~95%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑使用PEI-MAX[24]（2 mg/mL pH 7.5），在轉(zhuǎn)染前先需要將PEI-MAX 與OPTI（life technologies：31985-070）混合均勻，其比例為1 μL PEI-MAX∶50 μL OPTI 培養(yǎng)基。將敲除所需質(zhì)粒和攜帶抗性基因的質(zhì)粒pME-puro 與OPTI 培養(yǎng)基混合均勻，質(zhì)粒添加量的比例為4 μg DNA∶5 μL PEI-MAX。將PEIMAX 溶液和含質(zhì)粒溶液混勻，常溫放置25 min，使質(zhì)粒與PEI-MAX 結(jié)合。 之后將混合的溶液加入野生型細(xì)胞株的培養(yǎng)基中。 12 h 更換新鮮培養(yǎng)基，待生長恢復(fù)后（約24 h），更換為質(zhì)量濃度1 μg/mL 的嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

1.4 單克隆細(xì)胞的獲得與驗(yàn)證方法

篩選得到的細(xì)胞含有抗性質(zhì)粒和敲除質(zhì)粒，使用限制性稀釋使單個細(xì)胞生長于96 孔板中， 獲得單克隆細(xì)胞。 當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加后將單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)移至12 孔板培養(yǎng)。 當(dāng)其生長為100%狀態(tài)時，移去培養(yǎng)基，使用PBS 沖洗一次，加入胰蛋白酶（Sangon，CN）消化細(xì)胞，加入含10%FCS 的DMEM 培養(yǎng)基收獲細(xì)胞。 所得細(xì)胞液于3 000 r/min 離心2 min，并再次使 用 磷 酸 緩 沖 液 （phosphate buffered saline，PBS，Sangon，CN） 沖洗得到沉淀物。 在沉淀物中加入50 mmol/L NaOH 并于金屬浴中95 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mol/L 的Tris （pH 7.5） 于15 000 r/min離心3 min，取上清液待用。 驗(yàn)證方法使用測序驗(yàn)證的方式，將提取的基因組使用驗(yàn)證設(shè)計的驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證反應(yīng)， 反應(yīng)后的PCR 產(chǎn)物寄送華大基因測序公司進(jìn)行測序。 設(shè)計的驗(yàn)證引物為：

check MAN1A1F：TTCCTGCCAGACTCCTCCAAG；check MAN1A1R：CCACTCACCTCTTTGATCTTTGC C；check MAN1A2F：CTTAGTGCCTTCATCACTCTGT GT；check MAN1A2R：GACAGATTCGATCCAATCAC CGT。

1.5 流式細(xì)胞分析

細(xì)胞被胰蛋白酶消化處理后收集細(xì)胞液，用磷酸緩沖液洗滌1～2 次。 取5×105個細(xì)胞重懸于流式細(xì)胞分析液FACS（PBS，1% BSA 和0.1% ）中，加入帶有熒光標(biāo)記的凝集素， 如PHA-L4-FITC 和ConA-FITC（J-oil mills，Tokyo，Japan），使其終濃度為1%，反應(yīng)約15 min。 使用3 000 r/min 離心3 min后棄去上清液， 使用FACS 洗滌2 次后再次離心移去上清液并重懸于FACS 溶液中。 使用BD Accuri C6（BD，USA）流失細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞株中LAMP2 蛋白糖鏈變化的免疫印跡法驗(yàn)證

將細(xì)胞通過細(xì)胞裂解液裂解， 置于冰上孵育30 min。將細(xì)胞裂解提取液中蛋白質(zhì)變性，使用糖類內(nèi)切酶H（Endo-H，New England BioLabs）或PNGase F于37 ℃處理3 h。 處理后的蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE中上樣， 然后轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上。 使用鼠單克隆anti-LAMP2 抗體用于檢測細(xì)胞裂解提取液中的LAMP2 蛋白質(zhì)[25]。

1.7 細(xì)胞生長曲線的測定

將細(xì)胞消化后使用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。 將所得的細(xì)胞稀釋至2 000 個/dL 的細(xì)胞濃度，將該濃度的細(xì)胞分裝至96 孔板中，每孔體積為100 uL，將細(xì)胞放置于37 ℃、5%的條件下培養(yǎng)。 6 h 后在每孔內(nèi)加入CCK-kit（Dojingo，Japan）后培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h 后，在450 nm 納米波長下測定吸光度變化[26]，該結(jié)果即為0 h 數(shù)據(jù)， 之后每隔24 小時重復(fù)使用CCK-kit 測定，記錄下0、24、48、72、96、120、144 h 的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAN1A1 或MAN1A2 的單敲除細(xì)胞的構(gòu)建

當(dāng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)糖蛋白時由于發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的糖基化過程會產(chǎn)生在蛋白質(zhì)上糖鏈的異質(zhì)性。 糖鏈的異質(zhì)性是一個醫(yī)藥用糖蛋白生產(chǎn)中的一個重大的問題。 為了使糖鏈均一化，我們選擇使用人胚胎腎細(xì)胞HEK293 用于如病毒的生產(chǎn)和表達(dá)重組蛋白質(zhì)。 由于該細(xì)胞株為頻繁使用的人源細(xì)胞株，它具有如染色體數(shù)目和核苷酸多態(tài)性等完備的基因組信息，同時積累了大量應(yīng)用基因表達(dá)時的數(shù)據(jù)。 同時補(bǔ)充說明，在如中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）中已經(jīng)建立了懸浮培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)的方法，這些在構(gòu)建表達(dá)糖鏈均一化的重組蛋白質(zhì)細(xì)胞株中很有價值[27-28]。

為了構(gòu)建生產(chǎn)Man9 和Man8 為主要糖鏈結(jié)構(gòu)的高甘露糖型糖鏈的細(xì)胞株，我們著眼于定位在高爾基體的甘露糖苷酶Ⅰ。 大多數(shù)N-糖基化的蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體時， 其主要N-糖鏈結(jié)構(gòu)為Man9GlcNAc2 或Man8GlcNAc2 的結(jié)構(gòu)。 在高爾基體中，1，2-連接的甘露糖會被高爾基體甘露糖苷酶Ⅰ酶切至Man5GlcNAc2 結(jié)構(gòu)[29-30]。 在哺乳動物細(xì)胞中，存在3 種編碼高爾基體甘露糖苷酶Ⅰ的基因，MAN1A1、MAN1A2 和MAN1C1。 我們嘗試通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在HEK293 細(xì)胞中敲除MAN1A1和MAN1A2 基因。 對于每一個基因的敲除，我們在同一個外顯子上設(shè)計了兩個目標(biāo)序列。 當(dāng)敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，單克隆細(xì)胞被分離，單克隆細(xì)胞在外顯子區(qū)域的序列將會被分析，以確定基因是否成功敲除。 成功敲除基因的細(xì)胞在設(shè)計外顯子區(qū)域，兩個目標(biāo)序列之間的DNA 片段將會被移除， 我們篩選所有染色體在該區(qū)域的DNA 片段均被移除的細(xì)胞株。 細(xì)胞株A1-KO24 和A2-KO37 被認(rèn)為是MAN1A1-KO 和MAN1A2-KO 的單敲除細(xì)胞株。 相較于MAN1A1 基因序列，圖3 展示了對于單敲除細(xì)胞株MAN1A1-24 的測序結(jié)果，A1-KO24 細(xì)胞株在兩個目標(biāo)序列之間存在一個62 bp 的移除。 Cas9 蛋白質(zhì)正確地執(zhí)行了對于前間區(qū)序列臨近基序（PAM）上游3 bp 處目標(biāo)序列的移除，同時切口被非同源末端連接。 同時62 bp 的移除會造成MAN1A1基因內(nèi)的移碼突變。 同理， 圖4 為單敲除細(xì)胞株MAN1A2-KO37 的測序結(jié)果，A2-37 細(xì)胞株中也存在兩個目標(biāo)序列間的32 bp 的移除， 同時這個移除也會造成移碼突變。 這些結(jié)果顯示MAN1A1 和MAN1A2 成功地被敲除了。

圖3 MAN1A1-KO24 單敲除細(xì)胞株的性狀Fig. 3 Genotype of MAN1A1-KO24 cells

圖4 MAN1A2-KO37 單敲除細(xì)胞株的性狀Fig. 4 Genotype of MAN1A2-KO37 cells

2.2 構(gòu)建MAN1A1 和MAN1A2 的雙敲除細(xì)胞株

作者構(gòu)建了MAN1A1 和MAN1A2 雙敲除細(xì)胞株（D-KO）。 以A1-KO24 細(xì)胞株為親代，在該細(xì)胞株上敲除MAN1A2 基因。 在轉(zhuǎn)染敲除質(zhì)粒后，細(xì)胞被分離。 在敲除目標(biāo)序列附近的序列被測序分析，用來驗(yàn)證細(xì)胞株MAN1A2 被敲除。 對比A2-KO37細(xì)胞株， 雙敲細(xì)胞株double-KO 35 （D-KO35）在MAN1A2 目標(biāo)序列片段被測序后顯示具有3 條不同的結(jié)果。 結(jié)果如下： 野生型細(xì)胞中設(shè)計的MAN1A2 靶點(diǎn)之間的序列為aattCCACATGTAGATG CCGGTAAAGGggctaaaaaCCC CGGAGTCTTCCT； 最小的片段是因?yàn)閮赡繕?biāo)序列之間的DNA 片段被移除后裸露端重新連接而形成的aattCCACATAGTCT TCT，存在32 bp 的移除；中間的片段為在目標(biāo)靶點(diǎn)1 切除位點(diǎn)處插入了75 bp 長度來自于敲除質(zhì)粒的序列，75 bp 的序列為來自敲除質(zhì)粒上的氨芐抗性基因片段的TGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC CCAACGAT CAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATG TTGTGCAAA AAAGC，同時在目標(biāo)靶點(diǎn)2 的切除位點(diǎn)處有一個1 bp 的插入堿基；第3 種片段是由于目標(biāo)靶點(diǎn)1、2 的切除位點(diǎn)處存在2 bp（GA）和207 bp的插入片段，同樣來自于敲除質(zhì)粒的207 bp 的序列為AATAAAAATCATTAGGGGATTCATCAGGGCTTTG CGTTGTTTAATATCCTGATCCTGTCCGGGCGTCGG GCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGC GAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCA CTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTG CTATTCTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGC。因?yàn)? 種情況均造成移碼突變， 所以可以認(rèn)為DKO35 為MAN1A1 和MAN1A2 的雙敲除細(xì)胞株。

2.3 野生型細(xì)胞WT、 雙敲除細(xì)胞D-KO35 的生長情況的測定

在獲得了雙敲除細(xì)胞后，由于破壞高爾基體α-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ需要比較其是否對細(xì)胞生長狀態(tài)產(chǎn)生影響，同時也要確認(rèn)獲得的細(xì)胞株能否適應(yīng)生產(chǎn)的需要，需要對細(xì)胞的生長情況予以測定。 我們采用CCK-kit[26]對細(xì)胞的生長狀態(tài)進(jìn)行測定，見圖5。從圖5 可以看出，細(xì)胞增殖速率D-KO 細(xì)胞要低于WT 細(xì)胞。 說明通過對細(xì)胞高爾基體內(nèi)α1，2-甘露糖苷酶Ⅰ的破壞，會影響細(xì)胞增殖。 同時由于敲除α-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ的基因?qū)τ诩?xì)胞生長速率產(chǎn)生了影響， 我們也考慮之后通過其他手段，如過表達(dá)管家基因等方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長速率的上升。

圖5 野生型細(xì)胞和D-KO 細(xì)胞的生長曲線Fig. 5 Cell proliferation of WT and D-KO cells

2.4 通過流式分析對雙敲除細(xì)胞表面N-糖鏈結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行比較

為了驗(yàn)證D-KO 細(xì)胞株蛋白質(zhì)上糖鏈結(jié)構(gòu)的變化，我們使用多種凝集素來驗(yàn)證該變化。 凝集素是來源于植物、無脊椎動物等的一類糖蛋白，具有凝集血紅蛋白的作用。 凝集素具有識別糖蛋白上特定結(jié)構(gòu)的能力，因此在糖生物學(xué)研究中往往使用凝集素來驗(yàn)證蛋白質(zhì)上糖鏈的結(jié)構(gòu)。 我們使用表1 中的凝集素來與細(xì)胞表面蛋白質(zhì)反應(yīng)，由于這些凝集素帶有異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，當(dāng)凝集素與相應(yīng)識別的目標(biāo)糖鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合時， 帶有FITC 的熒光標(biāo)記可以幫助我們檢測到熒光變化，從而說明蛋白質(zhì)上具有可與該凝集素結(jié)合的結(jié)構(gòu)。 熒光的變化通過流失細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測。 通過所得到的結(jié)果可以計算樣品與凝集素的結(jié)合情況，即對應(yīng)于流失細(xì)胞分析儀中的峰的Mean 值。 通過對比野生型WT和D-KO 細(xì)胞中Mean 值的相對變化可以得出相對熒光強(qiáng)度， 結(jié)果見圖6。 圖6 縱坐標(biāo)表示以WT 的Mean 值為單位強(qiáng)度的反映D-KO 細(xì)胞株的各凝集素相對熒光強(qiáng)度值。 在圖6 中，對比表1 提供的各凝集素對于不同糖鏈結(jié)果的特異性識別數(shù)據(jù)，可以得出， 在D-KO 細(xì)胞相較于野生型，ConA-FITC 的相對熒光強(qiáng)度增加， 證明在D-KO 中高甘露糖型N-糖鏈有所增加，為野生型的5.02 倍。 同時，PHAL4-FITC、PHA-E4-FITC、ECA-FITC、DSA-FITC 的數(shù)據(jù)中，D-KO 細(xì)胞均具有明顯的變化，證明細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)上糖鏈中Galβ1、4-GlcNAc 和β1，4-GlcNAc 的結(jié)構(gòu)有明顯的減少， 證明復(fù)合型N-糖鏈結(jié)構(gòu)在D-KO 細(xì)胞株中明顯減少。

表1 流式分析使用的凝集素以及識別糖鏈特異性結(jié)構(gòu)信息Table 1 Lectin use for FACS and its target glycan structure

圖6 凝集素染色相對熒光強(qiáng)度Fig.6 Lectin staining and the relative fluorescence intensity

2.5 用western bolt 來驗(yàn)證雙敲除細(xì)胞株內(nèi)蛋白質(zhì)上N-糖鏈結(jié)構(gòu)的變化

在構(gòu)建了MAN1A1 和MAN1A2 的雙敲除細(xì)胞株后，我們認(rèn)為全細(xì)胞上的糖蛋白糖鏈的表型結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了一定程度的改變。 我們希望通過western blot 的手段來驗(yàn)證糖蛋白上糖鏈類型的改變， 因此我們選擇一種與溶酶體相關(guān)的膜蛋白LAMP2 來作為模式蛋白質(zhì)。 溶酶體相關(guān)膜蛋白2（Lysosome-associated membrane protein 2） 也稱作CD107b，LAMP2 蛋白質(zhì)是一種與溶酶體相關(guān)的糖蛋白。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，使用PBS 洗滌。在3 000 r/min 下離心3 min 棄去上清液， 將細(xì)胞重懸于細(xì)胞裂解液中，冰上放置30 min。 將細(xì)胞裂解細(xì)胞液的樣品通過SDS-PAGE 并使用anti-LAMP2 的鼠單克隆抗體識別LAMP2 蛋白質(zhì)。 在圖7 中，野生型和雙敲除細(xì)胞D-KO 中的LAMP2 蛋白質(zhì)大小有所不同，表明其蛋白質(zhì)上糖基化水平存在不同。 通過EndoH 和PNGaseF 處理后的條帶變化來看，可以證實(shí)這一假設(shè)。由于PNGaseF 可以移除幾乎所有的糖蛋白上N-糖鏈， 而EndoH 則可以代謝糖蛋白上高甘露糖型N-糖鏈。 在野生型中EndoH 處理后與雙敲除對比發(fā)現(xiàn)，PNGaseF 可以移除的糖鏈，EndoH不能很好地移除， 對比雙敲除細(xì)胞，LAMP2 對于EndoH 的敏感程度與WT 明顯不同， 進(jìn)一步表明LAMP2 上糖鏈表型發(fā)生了變化，即高甘露糖型糖鏈的比例增加，復(fù)合型糖鏈的比例在減少。

圖7 LAMP2 的免疫印跡結(jié)果Fig. 7 Western blot result of LAMP2

3 結(jié) 語

作者構(gòu)建了一種基于敲除高爾基體α-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ控制基因MAN1A1 和MAN1A2 的破壞來實(shí)現(xiàn)糖鏈高甘露糖型N-糖鏈增加的細(xì)胞株。 利用CRISPR/Cas9 系 統(tǒng)， 成 功 敲 除MAN1A1 和MAN1A2 基因，獲得雙敲除細(xì)胞株。 由于細(xì)胞內(nèi)高甘露糖型糖鏈的增加，使細(xì)胞在不同的凝集素染色下，通過流式分析儀分析可以觀察到細(xì)胞表面蛋白質(zhì)糖鏈表型變化。通過對比雙敲除細(xì)胞株和野生型細(xì)胞株的生長狀態(tài)以及胞內(nèi)溶酶體膜蛋白LAMP2的糖鏈變化，可以基本確定雙敲除細(xì)胞株胞內(nèi)蛋白質(zhì)糖鏈對于EndoH 的敏感性， 即蛋白質(zhì)糖鏈為高甘露糖型糖鏈的證明。 通過使高爾基體甘露糖苷酶基因的兩種基因被破壞或敲除，能夠獲得復(fù)合型糖鏈的含量大大降低、糖蛋白的穩(wěn)定性和安全性優(yōu)異的、 以高甘露糖型糖鏈為主要N-糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白。同時作者也提供了一種用于生產(chǎn)以高甘露糖型糖鏈為主要N-糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白的動物細(xì)胞株、 生產(chǎn)以高甘露糖型糖鏈為主要N-糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白的方法、通過該方法制備的糖蛋白以及該糖蛋白的用途。