產(chǎn)谷氨酸脫羧酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建與食品級表達

丁汪洋， 江 波， 沐萬孟， 張 濤

（食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫，214122）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）是一種含有4 個碳原子的非蛋白質(zhì)氨基酸，作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[1]。 大量的研究表明，GABA 具有許多重要的生理功能，如利尿、調(diào)節(jié)血壓、緩解精神焦慮、促進胰島素的分泌等[2-5]。因此，GABA 可以做為一種功能性的成分應用于食品和藥品領(lǐng)域[6]。

GABA 的制備方法有很多，如化學合成法、植物富集法、生物轉(zhuǎn)化法。 其中由于生物轉(zhuǎn)化法具有反應條件溫和，對環(huán)境友好，生產(chǎn)成本低而具有很好的應用前景[7]。對于生物轉(zhuǎn)化法制備GABA 主要是利用微生物表達的谷氨酸脫羧酶來催化底物谷氨酸或谷氨酸鹽脫羧來實現(xiàn)， 其中應用最廣泛的是利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA，但利用乳酸菌發(fā)酵有菌體量少、培養(yǎng)條件苛刻、 谷氨酸脫羧酶表達量少等缺點， 使得GABA 的生產(chǎn)成本較高。 近年來，有研究者利用基因工程的手段使得谷氨酸脫羧酶在大腸桿菌中得到大量表達，但大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，其在發(fā)酵后期會產(chǎn)生內(nèi)毒素，限制了其在食品工業(yè)上的應用[8]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種國際上公認（generally recognized as safe，GRAS）的安全微生物[9]。 有少量報道用枯草芽孢桿菌作為宿主，實現(xiàn)了外源谷氨酸脫羧酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達[10-12]，但重組枯草芽孢桿菌在這些已有報道中表達的谷氨酸脫羧酶的酶活普遍不高。 此外，在重組菌培養(yǎng)的過程中需要添加抗生素篩選重組子和維持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，無疑增加了生產(chǎn)成本和下游產(chǎn)物分離純化難度，難以實現(xiàn)工業(yè)的要求。

本研究從實驗室前期構(gòu)建的無抗生素基因多拷貝表達載體和D-丙氨酸消旋酶（dal）缺陷型枯草芽孢桿菌[12]出發(fā)，將密碼子優(yōu)化前后的Lactococcus lactis ssp. lactisIL1403 谷氨酸脫羧酶基因與無抗生素抗性多拷貝表達載體相連，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入兩種丙氨酸缺陷型的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞中，構(gòu)建了4 株無抗標記的重組枯草芽孢桿菌，首次實現(xiàn)了谷氨酸脫羧酶基因在枯草芽孢桿菌中的無抗高效表達。 通過篩選發(fā)酵酶活最高的重組菌株，并對初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行調(diào)整，重組枯草芽孢桿菌在調(diào)整后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵酶活最高可達7.4 U/mL，遠遠高于之前的有關(guān)報道，具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究用到的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 GABA、谷氨酸標品：美國Sigma 公司；OPA 衍生化試劑、硼酸鹽緩沖液 （pH 10.0）： 美國Agilent 公司； 引物合成、DNA 測序、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒：上海生工生物工程公司；DNA Mark、PrimeSTAR 酶、標準相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Mark：Takara 公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺：Bio-Rad 產(chǎn)品；其它試劑：購自國藥集團。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

液體LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10；pH 7.0。

固體LB 培養(yǎng)基： 液體LB 培養(yǎng)基中加入2.0 g/dL的瓊脂粉。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，大豆蛋白胨20，K2HPO4·12 H2O 0.3；pH 7.0。 菌株B.subtilisWB600（dal-）、B.subtilis1A751（dal-）培養(yǎng)時需在培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為200 μg/mL D-丙氨酸。搖瓶發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液體積分數(shù)為20%，接種體積分數(shù)為1%，37 °C、200 r/min 的條件下培養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器 PCR 擴增儀、 高速冷凍離心機：德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；Agilent 1200 高效液相色譜儀：美國Agilent 公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)、垂直電泳儀：上海天能公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏公司產(chǎn)品； 紫外-可見分光光度計： 上海UNICO 儀器公司產(chǎn)品；超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在NCBI 數(shù)據(jù)庫查找來源于Lactococcus lactisssp. lactis IL1403 的gadB基因序列（GeneBank NO:1114939），根據(jù)枯草芽孢桿菌的密碼子偏好性委托上海捷瑞生物工程公司對GAD 基因做密碼子優(yōu)化。本實驗所用到的引物由上海生工合成，引物序列見表2。

分 別 以pET-22b-gadB （ori）、pET-22b-gadB（opt） 為模板，P1/P2、P3/P4 為引物，PCR 擴增分別得到gadB（ori）、gadB（opt） 基因片段。 擴增條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)。以pUB-P43-DPE-dal 為模板，以P5/P6、P7/P8為 引 物，PCR 分 別 擴 增 出 對 應 于gadB（ori）、gadB（opt）基因的PUB-P43-dal（ori）、PUB-P43-dal（opt）表達載體片段，擴增條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30 個循環(huán)。 對4 種PCR 產(chǎn)物膠回收，然后參照文獻[14]的方法用重疊延伸PCR 擴增得到兩種PCR 多聚物， 重疊延伸PCR 條件為：98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30 個循環(huán)。 將兩種PCR 多聚物分別轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞中，PCR 多聚物在枯草芽孢桿菌內(nèi)源酶系統(tǒng)下進行重組得到重組表達質(zhì)粒pUB-P43-gadB（ori）-dal、pUB-P43-gadB（opt）-dal。

表2 引物列表Table 2 List of primers

1.2.2 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建 采用兩步（GMⅠ、GMⅡ）法[15]制作B.subtilisWB600（dal-）、B.subtilis1A751（dal-）感受態(tài)細胞，然后將兩種PCR 多聚物分別轉(zhuǎn)入B.subtilisWB600 （dal-）、B.subtilis1A751（dal-）感受態(tài)細胞中，在不添加D-丙氨酸的固體LB平板上分別篩選得到4 種重組菌B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB （ori）-dal、B.subtilisWB600/ pUBP43-gadB（opt）-dal、B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB（ori）-dal、B.subtilis1A751/pUB-P43-gadB（opt）-dal。

1.2.3 目的蛋白質(zhì)的純化及SDS-PAGE 檢測 目的基因在設(shè)計引物的時候添加了6 個組氨酸標簽，重組蛋白質(zhì)可以通過鎳柱純化出來。 重組菌超聲破碎前先用終質(zhì)量濃度為50 mg/mL 溶菌酶在37 °C 下反應30 min，具體純化步驟參照文獻[16]描述的方法進行。 利用粗酶液和純化后的酶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后在凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.4 菌懸液的制備 將發(fā)酵液在4°C 于8 000 r/min離心10 min，棄清液，得到濕菌體。用0.1 mol/L、pH 4.5的醋酸鹽緩沖液洗滌菌體兩次，按照相同發(fā)酵液體積加入0.1 mol/L、pH 4.5 的醋酸鹽緩沖液，反復吹打均勻制得菌懸液。

1.2.5 谷氨酸脫羧酶發(fā)酵酶活測定 1 mL 轉(zhuǎn)化反應體系中含有800 μL 濃度為0.1 mol/L 的谷氨酸鈉（溶解在0.1 mol/L 的醋酸鈉緩沖溶液中，pH 4.5）、200 μL 菌懸液。轉(zhuǎn)化體系在50 ℃的恒溫水浴鍋中反應10 min 后立即放入沸水中煮沸5 min， 終止其反應。轉(zhuǎn)化體系經(jīng)過滅酶后于12 000 r/min 離心10 min，取上清液，通過高效液相色譜計算轉(zhuǎn)化液中GABA 含量。

酶活力單位定義:反應液中，每分鐘催化底物生產(chǎn)1 μmoL GABA 所需要酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.2.6 高效液相色譜檢測 GABA 的檢測采用OPA 在線衍生的方法： 取滅酶后的轉(zhuǎn)化液于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min， 上清液用5 g/dL TCA 稀釋適當倍數(shù)后于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取離心后的上清液過0.45 μm 的濾膜， 通過安捷倫1200 高效液相色譜儀檢測轉(zhuǎn)化液的GABA 濃度。色譜條件參照文獻[17]的方法設(shè)定：色譜柱為Hypersil ODS 分析柱 （Agilent，4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相A （4.5 g/L 醋酸鈉，200 μL/L 三乙胺，5 mL/L四氫呋喃，pH 7.2）、流動相B（22.6 g/L 醋酸鈉，pH 7.2，甲醇∶乙腈以體積比1∶2 混合）；流速1 mL/min；進樣體積1 μL；柱溫40 ℃；DAD 紫外檢測器，檢測波長338 nm。

1.2.7 菌體生物量的測定 利用紫外-可見光分光光度計檢測經(jīng)適當稀釋的菌液在600 nm 波長處的吸光度值，即OD600。

1.2.8 碳源對重組菌的生長和發(fā)酵酶活的影響 在原始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變的情況下研究不同碳源對生物量和發(fā)酵酶活的影響，確定最佳碳源后研究最佳碳源的質(zhì)量濃度對重組菌生物量和發(fā)酵

酶活的影響。

1.2.9 氮源對重組菌生長和發(fā)酵酶活的影響 在優(yōu)化好碳源的基礎(chǔ)上研究不同氮源對生物量和發(fā)酵酶活的影響，確定最佳氮源后研究最佳氮源的質(zhì)量濃度對重組菌生物量和發(fā)酵酶活的影響。

1.2.10 無機鹽對重組菌生長和發(fā)酵酶活的影響在優(yōu)化好碳氮源的基礎(chǔ)上分別添加終質(zhì)量濃度為100 mg/L 的MgSO4·7H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O，研究不同種類的無機鹽對重組菌生物量和發(fā)酵酶活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

PCR 擴增出的片段經(jīng)瓊脂糖電泳檢測， 結(jié)果見圖1。密碼子優(yōu)化前后gadB基因片段大小為1 401 bp、無抗表達載體pUB-P43-dal（抗性基因被D-丙氨酸消旋酶基因代替[13]）片段大小為3 847 bp、密碼子優(yōu)化前后的gadB基因與無抗表達載體通過重疊延伸PCR 形成的PCR 多聚物（相對分子質(zhì)量很大，在泳道里）。 將兩種多聚物分別轉(zhuǎn)入兩種丙氨酸缺陷型枯草芽孢桿菌WB600、1A751 中， 多聚物在枯草桿菌細胞中重組形成重組質(zhì)粒pUB-P43-gadB （ori）-dal、pUB-P43-gadB（opt）-dal，大小為5 247 bp，得到4 株重組菌B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB （ori）-dal、B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB（opt）-dal、B.subtilis1A751/pUB-P43-gadB （ori）-dal、B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB（opt）-dal。 由于重組質(zhì)粒上含有D-丙氨酸消旋酶基因，含有重組質(zhì)粒的D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢桿菌可以在不加D-丙氨酸的培養(yǎng)基上生長，以此篩選出重組子。

圖1 基因片段PCR 擴增產(chǎn)物Fig. 1 PCR products of different genes

2.2 SDS-PAGE 分析

重組菌B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB（ori）-dal 在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h 后離心， 收集濕菌體，經(jīng)超聲破碎、離心后，得到上清液即為粗酶，上清液經(jīng)鎳柱純化后得到純化后的GAD。粗酶和純酶經(jīng)SDS-PAGE 檢測見圖2，大約在54 000 處有明顯的蛋白質(zhì)條帶，與張?zhí)烀鹊萚18]報道的一致，表明重組菌成功地表達了目的蛋白質(zhì)。

圖2 谷氨酸脫羧酶的SDS-PAGE 檢測Fig. 2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of GAD

2.3 4 種重組菌在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況比較

從LB 平板上挑單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)12 h 后按1%的接種體積分數(shù)接種到原始發(fā)酵培養(yǎng)基中， 隔一定時間取樣測發(fā)酵液的OD600和發(fā)酵酶活，得到4 株重組菌的生長曲線和產(chǎn)酶曲線，見圖3～4。 由圖3 可知，4 株重組菌的生長量相差不大， 重組菌B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB(ori)-dal、B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB (opt)-dal的生物量略高于B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB(ori）-dal、B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB(opt)-dal。4 株重組菌的發(fā)酵酶活相差較大，說明GAD 的發(fā)酵酶活不僅跟宿主的類型有關(guān)，還跟目的基因密碼子優(yōu)化情況有關(guān)。 對于同種類型的宿主，GAD 基因通過密碼子優(yōu)化后重組菌的發(fā)酵酶活都得到了較大幅度的提升，對于同種類型的重組質(zhì)粒，谷氨酸脫羧酶在宿主B.subtilisWB600 中表達比在宿主B.subtilis1A751 中表達更加高效。 原因可能是B.subtilisWB600 與B.subtilis1A751 相比，其敲除的蛋白質(zhì)基因更多，可能會促使宿主將更多的能量用于表達外源基因。 最后選取酶活最高的B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB（opt）-dal 做后續(xù)優(yōu)化研究。

圖4 4 株重組菌的發(fā)酵酶活曲線Fig. 4 GAD production curves of four recombinant strains

2.4 碳源對重組菌生長和發(fā)酵酶活的影響

圖5 不同碳源對發(fā)酵酶活和生物量的影響Fig. 5 Effect of carbon source on GAD production and biomass

在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變的情況下，分別以10.0 g/L 的葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、玉米糊精、可溶性淀粉作為碳源，在37 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h 后，取樣測定不同碳源對發(fā)酵酶活和生物量的的影響，見圖5。由圖5 可知， 重組菌對麥芽糖的利用效果最好，OD600達到8.69，以蔗糖做為碳源，重組菌的發(fā)酵酶活最高，可達5.79 U/mL。 以蔗糖做為碳源，選取質(zhì)量濃度5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L 的蔗糖，研究不同蔗糖質(zhì)量濃度對重組菌發(fā)酵酶活和生物量的影響，見圖6。 結(jié)果表明， 重組菌的生物量隨蔗糖質(zhì)量濃度的增加會有小幅度的提升。 當蔗糖的質(zhì)量濃度為10.0 g/L 時，重組菌的發(fā)酵酶活最大，達到4.0 U/mL。 蔗糖質(zhì)量濃度超過10.0 g/L 時，重組菌的發(fā)酵酶活會逐漸降低。

圖6 蔗糖添加量對發(fā)酵酶活和生物量的影響Fig. 6 Effect of sucrose concentration on GAD production and biomass

2.5 氮源對重組菌生長和發(fā)酵酶活的影響

圖7 不同氮源對發(fā)酵酶活和生物量的影響Fig. 7 Effect of nitrogen source on GAD production and biomass

以10.0 g/L 的蔗糖作為碳源， 分別以20.0 g/L的胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、酵母膏、大豆蛋白胨、牛肉膏作為氮源，在37 ℃，200 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h 后離心收集菌體，測定不同氮源對發(fā)酵酶活和生物量的影響，見圖7。 結(jié)果表明，重組菌對酵母膏的利用效果最好，OD600可達到13.8， 以大豆蛋白胨做為氮源時重組菌產(chǎn)酶最多，發(fā)酵酶活可達5.06 U/mL。 以大豆蛋白胨作為氮源，選取質(zhì)量濃度10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35 g/L 的大豆蛋白胨，研究不同大豆蛋白胨濃度對發(fā)酵酶活和菌體濃量的影響，見圖8。 結(jié)果表明，當大豆蛋白胨質(zhì)量的質(zhì)量濃度為30.0 g/L 時， 重組菌的發(fā)酵酶活最高，達到7.02 U/mL。

圖8 大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對發(fā)酵酶活和生物量的影響Fig. 8 Effect of soy peptone concentration on GAD production and biomass

2.6 無機鹽對重組菌生長和發(fā)酵酶活的影響

無機鹽對重組菌的生長繁殖與外源蛋白質(zhì)的表達也有很大的聯(lián)系。 在優(yōu)化好的碳氮源的基礎(chǔ)上， 分別添加終質(zhì)量濃度為100 mg/L 的MgSO4·7H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O，在37 ℃、200 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h后離心收集菌體，測定5 種無機鹽對發(fā)酵酶活和生物量的影響，見圖9。 對照組不加無機鹽，其他條件保持一樣。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組的OD600達到11.98，酶活達到7.4 U/mL，與對照組相比，無機鹽的添加使重組菌的生物量和發(fā)酵酶都有一定程度的降低。

圖9 無機鹽種類對發(fā)酵酶活和生物量的影響Fig. 9 Effect of inorganic salt on GAD production and biomass

3 結(jié) 語

根據(jù)枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化了來源于Lactococcus lactis ssp. lactisIL1403 的谷氨酸脫羧酶基因，將優(yōu)化前后的目的基因與無抗表達載體相連， 分別轉(zhuǎn)入D-丙氨酸缺陷型的B.subtilisWB600（dal-）、B.subtilis1A751（dal-）感受態(tài)細胞中，得到4 種無抗標記的重組枯草芽孢桿菌，通過測定4 株重組枯草芽孢桿菌進行生長曲線和發(fā)酵酶活曲線，發(fā)現(xiàn)重組枯草芽孢桿菌中的發(fā)酵酶活不僅與目的基因密碼子優(yōu)化情況有關(guān)，還有宿主類型有關(guān)，目的基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后在同一類型的宿主中的表達效率要大大高于優(yōu)化前， 同一基因在B.subtilisWB600 中的表達效率要高于B.subtilis1A751。選擇產(chǎn)酶效率最高的重組菌B.subtilisWB600/ pUBP43-gadB（opt）-dal，并調(diào)整了初始發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，最終重組菌的發(fā)酵酶活可達7.4 U/mL，大大高于已報道谷氨酸脫羧酶在枯草芽孢桿菌中表達的最高酶活，具有很大的工業(yè)化全細胞生產(chǎn)食品級γ-氨基丁酸的潛力，有望解決在微生物法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的工藝中大腸桿菌安全性的問題以及乳酸菌成本過高、產(chǎn)量低的問題。