Bacillus stearothermophilus 麥芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis 中的重組表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化

李雨桐， 宿玲恰， 吳 敬， 吳 丹

（1. 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江南大學(xué)， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122；3. 江南大學(xué) 教育部食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

麥芽糖淀粉酶（Maltogenicamylases，EC3.2.1.133），是糖苷水解酶13 家族中的一員[1]，可以催化麥芽三糖、淀粉和糊精中（1→4）-α-D-糖苷鍵的水解，通常在外部隨機(jī)水解，也可進(jìn)行內(nèi)部水解[2]。 除了水解作用外，麥芽糖淀粉酶還催化轉(zhuǎn)糖基作用的進(jìn)行[3]。 麥芽糖淀粉酶在淀粉糖化工業(yè)、食品烘焙、面粉工業(yè)中的應(yīng)用廣泛[4]。 特別是麥芽糖淀粉酶能夠減少支鏈淀粉的老化，在烘培工業(yè)中可作為抗老化劑水解淀粉生成麥芽糖和部分糊精，延長(zhǎng)烘焙食品的貨架期[2,5]，減少食品的浪費(fèi)。

麥芽糖淀粉酶來源眾多， 包括地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[6]、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）[7]、嗜熱放線菌（Thermus vulgaris）[8]等。 目前，研究者主要將麥芽糖淀粉酶在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)[9]，但因?yàn)榇竽c桿菌在生長(zhǎng)產(chǎn)酶的過程中會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素等， 是一種致病菌，對(duì)人體不利，限制了其應(yīng)用。 而枯草芽孢桿菌是一種非致病的土壤微生物，已被美國食品藥物管理局以及中國相關(guān)部門認(rèn)定為是一種食品安全級(jí)菌株GRAS（Generally recognized as safe）。 且其具有良好的蛋白質(zhì)合成和分泌能力、 清楚的分子遺傳背景、較為成熟的發(fā)酵工藝，是工業(yè)生產(chǎn)酶制劑的典型菌株，因此以枯草芽孢桿菌為宿主進(jìn)行麥芽糖淀粉酶的生產(chǎn)具有很大優(yōu)勢(shì)[10-11]。

目前已有多篇報(bào)告研究了不同來源的麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)。 1984 年，位于日本的Outtrap 團(tuán)隊(duì)首次以枯草芽孢桿菌為宿主克隆表達(dá)了來源于B. stearothermuphilus的麥芽糖淀粉酶，并對(duì)其性質(zhì)和應(yīng)用都做了初步的探究[12]。更有全球工業(yè)酶制劑主導(dǎo)企業(yè)諾維信公司，推出了主打產(chǎn) 品“Novamyl”，是B. stearothermuphilus麥芽糖淀粉酶以枯草芽孢桿菌為宿主，經(jīng)深層發(fā)酵以及蛋白質(zhì)純化制成[13]。沈微等人在地衣芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶5′端添加地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因信號(hào)肽后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，最終發(fā)酵上清液酶活為5.9 U/mL[14]。2016 年，柳梅梅等人以pHCMCO4-Pglv 為載體，重組構(gòu)建綠色糖單孢菌麥芽糖淀粉酶基因并轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中表達(dá)，胞外酶活可達(dá)257 U/mL[15]。 楊韻霏等人則實(shí)現(xiàn)了地衣芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的高效異源表達(dá)，酶活高達(dá)296.64 U/mL[10]。

有研究表明，氮源、碳源的種類和濃度對(duì)枯草芽孢桿菌表達(dá)目的產(chǎn)物的多少具有很大的影響，在高密度補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，補(bǔ)料的碳源、氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物的產(chǎn)生也都有著重要的影響[16-17]。

來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶在細(xì)菌麥芽糖淀粉酶中其溫度穩(wěn)定性最好，80 ℃保溫35 h 后仍有50%的酶活力，在麥芽糖漿制備和抗面包老化中應(yīng)用性能良好[17-18]。 本研究將嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)；對(duì)麥芽糖淀粉酶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵的氮源種類、氮源質(zhì)量濃度、碳源質(zhì)量濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳產(chǎn)酶條件；對(duì)其最適溫度、最適pH、Km及比活等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 菌株Escherichia coliJM109 和Bacillus subtilisCCTCC M 2016536、質(zhì)粒pHY300PLK（帶有amyE 啟動(dòng)子與YvcE 信號(hào)肽）和opt-amyM/T：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 酶與主要試劑 In-Fusion HD Cloning Plus kit 試劑盒、Primer Star Taq DNA 聚合酶、dNTPs、四環(huán)素、氨芐抗生素：均購自Takara 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 純化試劑盒、DNA 回收試劑盒： 均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉：購自英國Oxiod 公司；其他試劑如氯化鈉、甘油等：均購自國藥集團(tuán)；引物：購自上海睿迪生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化鈉10.0。

LB 固體培養(yǎng)基： 在LB 液體培養(yǎng)基中加入1.5～2.0 g/dL 的瓊脂糖。

Terrifie Broth（TB）培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉24.0，蛋白 胨12.0， 甘 油5.0，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以質(zhì)粒opt-amyM/T為模板，按照In-Fusion HD Cloning Plus kit 試劑盒要求的同源臂引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物如下：F1：5’-AAAACT GCATCGGCGTCTTCTTCTGCAAGCGTTAAA-3’，R1：5’-TTTATTACCAAGCTTTTAGTTCTGCCAAGTCAC AGTAATG-3’。 以pHY300PLK 載體質(zhì)粒為模板，以同源臂引物設(shè)計(jì)原則為準(zhǔn)則，設(shè)計(jì)引物如下：F2：5’-AAGCTTGGTAATAAAAAAACA-3’，R1：5’-CGCCG ATGCAGTTTTACTTG-3’。

1.2.2 運(yùn)用PCR 擴(kuò)增獲得目的基因與表達(dá)載體 以質(zhì)粒opt-amyM/T為模板，正反向引物為F1/R1 擴(kuò)增amyM 基因片段。PCR 的參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃5 min，變性98 ℃10 s，退火55 ℃15 s，延伸72 ℃2 min 10 s，30 個(gè)循環(huán)；保存：72 ℃10 min，之后存放于4 ℃。

質(zhì)粒pHY300PLK 作為為模板， 正反向引物為F2/R2 擴(kuò)增表達(dá)載體片段。 進(jìn)行PCR 的參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃5 min，變性98 ℃10 s，退火55 ℃15 s，延伸72℃6 min，30 個(gè)循環(huán)； 保存：72 ℃10 min，之后存放于4℃。

1.2.3 連接與鑒定 目的基因與表達(dá)載體經(jīng)過PCR 擴(kuò)增及核酸膠跑膠回收， 根據(jù)In-Fusion@HD Cloning Kit 試劑盒要求， 按照插入片段和載體的摩爾比例為2∶1 進(jìn)行混合。 連接體系中連接酶5X In-Fusion HD Enzyme Premix 為2 μL，插入片段和載體經(jīng)回收后測(cè)出DNA 濃度，計(jì)算加入量，最后用dH2O補(bǔ)齊總體系至10 μL。 連接完畢后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞。

培養(yǎng)后涂布含100 μg/mL 氨芐抗生素的LB 固體平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。 待單菌落長(zhǎng)出后，于LB 液體培養(yǎng)基中挑入單菌落培養(yǎng)8~10 h，收集菌體抽提質(zhì)粒，分別用F1/R1 與F2/R2 為引物并以此質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序， 測(cè)序正確后轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主Bacillus subtilisCCTCC M 2016536 感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后涂布含20 μg/mL 四環(huán)素抗性的LB 固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)8~10 h，待單菌落長(zhǎng)出后于液體LB 中挑入單菌落并培養(yǎng)8~10 h，保存至甘油管中（甘油終體積分?jǐn)?shù)15%）并收集菌體抽提質(zhì)粒， 用1.2.1 中引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證正確后確定轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵 從甘油管中以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種入LB 液體培養(yǎng)基中（含20 μg/mL 四環(huán)素抗性），37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)8~10 h。 以5%接種體積分?jǐn)?shù)至TB 培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)2 h 后轉(zhuǎn)入33 ℃培養(yǎng)48 h。 發(fā)酵完畢后離心10 min，棄去菌體沉淀，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，取發(fā)酵上清液即為酶液。

1.2.5 麥芽糖淀粉酶活力的測(cè)定及蛋白質(zhì)檢測(cè)酶活測(cè)定方法使用DNS 法[12]，配置1%的可溶性淀粉溶液，取1 mL 于試管中，加入50 mmol/L、pH 5.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液900 μL， 于60 ℃預(yù)熱10 min 后加入100 μL 酶液反應(yīng)10 min，反應(yīng)以加入3 mL DNS 進(jìn)行終止，在100 ℃沸水中煮沸7 min 進(jìn)行顯色， 冷卻后加入10 mL 水至終體積為15 mL，于540 nm 處測(cè)量吸光值。 麥芽糖淀粉酶酶活單位定義為：在上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)淀粉水解活力單位[9]。 使用SDS-PAGE 對(duì)麥芽糖淀粉酶進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 菌濃（OD600）的測(cè)定 用分光光度計(jì)在600 nm處進(jìn)行吸光值的測(cè)量， 此時(shí)應(yīng)將發(fā)酵液稀釋得當(dāng)，菌濃（OD600）=稀釋倍數(shù)×600 nm 處的度數(shù)。

1.2.7 搖瓶發(fā)酵中培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響 考察多種酵母粉、工業(yè)蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉、玉米漿、酵母浸膏6 種氮源、酵母浸膏和大豆蛋白胨的氮源復(fù)配對(duì)產(chǎn)酶的影響。 氮源分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g/L；甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精6 種碳源，分別為1.0，5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L； 初始pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；發(fā)酵溫度分別為33、37、41、45、49 ℃。

1.2.8 對(duì)麥芽糖淀粉酶進(jìn)行純化 為進(jìn)一步對(duì)麥芽糖淀粉酶進(jìn)行性質(zhì)分析，因此對(duì)麥芽糖淀粉酶進(jìn)行純化。 通過熱處理、硫酸銨沉淀、過夜透析、Mono QTM10/100 GL 陰離子交換色譜柱過柱后，麥芽糖淀粉酶可以達(dá)到電泳純。

1.2.9 麥芽糖淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1）最適反應(yīng)pH 的研究：在60 ℃下，分別測(cè)定在 不 同pH 緩 沖 溶 液（2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5） 配制的可溶性淀粉底物中的水解酶活力，以測(cè)得的最高酶活力值為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定最適的反應(yīng)pH。

2）最適反應(yīng)溫度的研究：在最適pH 的條件下，分別測(cè)定在不同溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）下麥芽糖淀粉酶的淀粉水解活力，以測(cè)得的最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。

3）在最適溫度下麥芽糖淀粉酶半衰期的測(cè)定：將麥芽糖淀粉酶置于最適反應(yīng)溫度下，每過一段時(shí)間取樣，測(cè)量酶活，以未處理的酶活力為100%，計(jì)算在最適反應(yīng)溫度下酶的半衰期。

4）麥芽糖淀粉酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：用最適反應(yīng)pH 緩沖液配制可溶性淀粉底物， 于最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶活的測(cè)量。 在上述條件下，配制不同濃度的可溶性淀粉溶液，分別測(cè)定麥芽糖淀粉酶初始水解活力，采用GraphPad Prism 5.0 軟件，得到米氏（Michaelis-Menten）方程，計(jì)算得到Kcat值。

5）麥芽糖淀粉酶比活力的測(cè)定：在最適反應(yīng)條件下測(cè)定純化后麥芽糖淀粉酶酶活，采用考馬斯亮藍(lán)染色（Bradford）法測(cè)定純化后酶的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算麥芽糖淀粉酶比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建與搖瓶發(fā)酵

以質(zhì)粒opt-amyM/T為模板， 用PCR 儀擴(kuò)增amyM基因。以質(zhì)粒pHY300PLK（帶有amyE 啟動(dòng)子與YvcE 信號(hào)肽）為模板，用PCR 儀擴(kuò)增出表達(dá)載體片段。 擴(kuò)增出的目的基因及表達(dá)載體產(chǎn)物用1.0 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的基因與表達(dá)載體片段大小分別約為2 100、5 900 bp。 驗(yàn)證正確后用1.0 g/dL的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離回收。 目的基因片段與表達(dá)載體片段用In-Fusion 連接酶連接后轉(zhuǎn)入E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞中， 培養(yǎng)并涂布于固體LB 平板上，過夜培養(yǎng)后挑單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8~10 h 后抽提質(zhì)粒，PCR 驗(yàn)證正確后將質(zhì)粒送于測(cè)序公司， 序列驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主B.subtilisCCTCC M 2016536 中，培養(yǎng)后涂布LB 平板，挑單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，確定重組菌株構(gòu)建成功， 保菌于15%甘油管中，見圖1。

圖1 麥芽糖淀粉酶瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of maltogenic amylases

重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，48 h 后發(fā)酵完畢， 離心取發(fā)酵上清液即為麥芽糖淀粉酶酶液， 對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE 分析，見圖2。 相對(duì)分子質(zhì)量69 000附近出現(xiàn)明顯的特異性蛋白質(zhì)條帶， 為麥芽糖淀粉酶理論相對(duì)分子質(zhì)量。 測(cè)定重組菌胞外酶活力為250.7 U/mL。

圖2 麥芽糖淀粉酶蛋白質(zhì)電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of maltogenic amylases

2.2 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 氮源種類對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 分別以酵母粉、工業(yè)蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉、酵母浸膏及玉米漿代替TB 培養(yǎng)基中的酵母粉和蛋白胨進(jìn)行氮源優(yōu)化。固定其質(zhì)量濃度為15 g/L，其他培養(yǎng)基中成分不變，按1.2.4 進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，見圖3。采用酵母浸膏作為氮源時(shí)，48 h 胞外酶活最高可達(dá)315.68 U/mL， 但此時(shí)菌體濃度最低， OD600只能達(dá)到3.8 左右； 而大豆蛋白胨作為培養(yǎng)基中惟一氮源時(shí)，酶活只能達(dá)到270.64 U/mL，但是此時(shí)菌體濃度能達(dá)到5.8 左右， 是這幾種氮源中最能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的氮源。

圖3 氮源種類對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig. 3 Effects of various nitrogen sources on biomass and maltogenic amylases production

2.2.2 氮源復(fù)配對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 以總氮源為15 g/L，分別以酵母浸膏7.5 g/L 與同樣質(zhì)量濃度的酵母粉、工業(yè)蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽粉及玉米漿作為復(fù)合氮源。 如圖4 所示，當(dāng)酵母浸膏與大豆蛋白胨進(jìn)行復(fù)配后，48 h 胞外酶活最高可達(dá)329.67 U/mL，且其OD 為4.5，因此采用酵母浸膏與大豆蛋白胨復(fù)合氮源作為重組菌的氮源。

圖4 氮源復(fù)配對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Effect of nitrogen source compounding on biomass and maltogenic amylases production

2.2.3 復(fù)配時(shí)大豆蛋白胨與酵母浸膏的質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響 因酵母浸膏對(duì)菌體產(chǎn)酶影響最大， 因此首先以5 g/L 大豆蛋白胨分別與5、10、15、20、25、30 g/L 酵母浸膏進(jìn)行復(fù)配作為總氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，見圖5。隨著酵母浸膏質(zhì)量濃度的升高，菌體生長(zhǎng)也不斷增加。 在酵母浸膏質(zhì)量濃度為15~25 g/L 之間時(shí)， 菌體產(chǎn)酶最為適宜且相差不大，但氮源質(zhì)量濃度在25 g/L 以下時(shí)菌體生長(zhǎng)不好，因此以25 g/L 酵母浸膏為最適。 在此基礎(chǔ)上，以25 g/L酵母浸膏分別與1、5、10、15、20、25、30 g/L 大豆蛋白胨進(jìn)行復(fù)配作為總氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，見圖6。隨著大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的升高， 菌體生長(zhǎng)更加良好， 但是當(dāng)大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度超過15 g/L 時(shí)，菌體生長(zhǎng)開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，菌體的生長(zhǎng)反而受到了抑制，可能是因?yàn)榈吹馁|(zhì)量濃度過高導(dǎo)致。 而菌體產(chǎn)酶隨著大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的升高而降低，其中以5 g/L 大豆蛋白胨最佳。 因此以25 g/L 酵母浸膏與5 g/L 大豆蛋白胨作為培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源，酶活可達(dá)345 U/mL。

圖5 復(fù)配時(shí)酵母浸膏的質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響Fig. 5 Effect of yeast extract concentration on biomass and maltogenic amylases production

圖6 復(fù)配時(shí)大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響Fig. 6 Effect of soy peptone concentration on biomass and maltogenic amylases production

2.2.4 碳源種類對(duì)重組菌和產(chǎn)酶的影響 選擇2.2.3 中優(yōu)化出的復(fù)合氮源作為培養(yǎng)基中的氮源，以5 g/L 的甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精分別作為培養(yǎng)基中惟一碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果見圖7。以葡萄糖或甘油為碳源時(shí)，菌體的生長(zhǎng)濃度及產(chǎn)酶都很相近，而其他種類的碳源產(chǎn)酶均低于這兩種碳源，表明葡萄糖和甘油對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶均具有良好的作用。 而在甘油和葡萄糖中，以甘油為惟一碳源時(shí)菌體產(chǎn)酶最佳，最高酶活為345.7 U/mL。

圖7 碳源種類對(duì)重組菌和產(chǎn)酶的影響Fig. 7 Effect of various carbon source on biomass and maltogenic amylases production

2.2.5 碳源質(zhì)量濃度對(duì)重組菌和產(chǎn)酶的影響 以甘油為培養(yǎng)基中惟一碳源進(jìn)行最佳碳源質(zhì)量濃度的探究。 以優(yōu)化好的復(fù)合氮源作為惟一氮源，分別以1、5、10、15、20、25 g/L 的甘油作為培養(yǎng)基中惟一碳源，結(jié)果見圖8。菌體的生長(zhǎng)濃度顯示不同碳源質(zhì)量濃度對(duì)其影響并不大，但是隨著甘油質(zhì)量濃度的升高，菌體產(chǎn)酶逐漸下降，推測(cè)枯草芽孢桿菌在低質(zhì)量濃度碳源下更利于產(chǎn)酶，以5 g/L 的甘油為最佳。

圖8 碳源質(zhì)量濃度對(duì)重組菌和產(chǎn)酶的影響Fig. 8 Effect of carbon source concentration on biomass and maltogenic amylases production

2.2.6 初始pH 對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 確定了培養(yǎng)基中的氮源和碳源后，為了進(jìn)一步優(yōu)化重組菌最適生長(zhǎng)產(chǎn)酶條件， 確定初始pH 對(duì)重組菌的影響， 使用磷酸和氨水對(duì)初始培養(yǎng)基的pH 進(jìn)行調(diào)整并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。 如圖9 所示，隨著pH 的升高，菌體濃度逐漸下降，推測(cè)枯草芽孢桿菌在偏酸的環(huán)境中更易生長(zhǎng)， 酶活在pH 6.5 處達(dá)到最高， 隨著pH的升高或者降低都逐漸降低， 因此確定最佳初始pH 為6.5，此時(shí)麥芽糖淀粉酶胞外酶活為357.7 U/mL。

圖9 初始pH 對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig. 9 Effect of initial pH on biomass and maltogenic amylases production

2.2.7 溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶過程都具有很大的影響， 適宜的溫度會(huì)使菌體保持良好的活力， 促進(jìn)菌體產(chǎn)酶。 用上述優(yōu)化好的條件，研究溫度對(duì)重組菌的影響。 如圖10 所示，研究33、37、41、45、49 ℃下重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況。 隨著溫度的升高，菌體的生長(zhǎng)濃度逐漸降低，可見在高溫下，菌體生長(zhǎng)情況并不良好。 但是隨著溫度升高， 菌體產(chǎn)酶逐漸增加，在41 ℃達(dá)到最佳，為396 U/mL；隨后逐漸下降，在49 ℃出現(xiàn)大幅度的下降， 因此確定41 ℃進(jìn)行搖瓶發(fā)酵為最佳。

圖10 溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig. 10 Effect of temperature on biomass and maltogenic amylases production

2.3 麥芽糖淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的鑒定

2.3.1 最適反應(yīng)pH 的研究 將麥芽糖淀粉酶置于不同pH （2.5~8.5）緩沖液中測(cè)定酶活力。 如圖11 所示， 麥芽糖淀粉酶在pH 3.5~7 之間均保有60%以上的酶活力。低于3.5 及高于7 時(shí)，酶活力迅速下降，在pH 5.5 時(shí)最適。表明麥芽糖淀粉酶的適應(yīng)pH 范圍較廣，且在偏酸環(huán)境下更為適宜。

圖11 最適反應(yīng)pH 值Fig. 11 Optimal pH

2.3.2 最適反應(yīng)溫度的研究 將麥芽糖淀粉酶置于pH 5.5 下，于不同溫度（30~90 ℃）中測(cè)量酶活，結(jié)果見圖12。 60 ℃為最適反應(yīng)溫度，50~80 ℃下均保留有80%以上的酶活， 且低于40 ℃時(shí)酶活較大幅度下降。 由此可見，麥芽糖淀粉酶的適應(yīng)溫度范圍較廣，且更適宜于高溫。

圖12 最適反應(yīng)溫度Fig. 12 Optimal temperature

2.3.3 最適溫度下的麥芽糖淀粉酶半衰期的測(cè)定將麥芽糖淀粉酶置于60 ℃水浴鍋中， 每隔一段時(shí)間取樣測(cè)量酶活， 以確定麥芽糖淀粉酶的半衰期，見圖13。麥芽糖淀粉酶在60 ℃下，半衰期高達(dá)325 h 之久，十分穩(wěn)定。

圖13 重組麥芽糖淀粉酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 13 Temperature stability of recombinant maltogenic amylase

2.3.4 對(duì)麥芽糖淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及比酶活的測(cè)量 用麥芽糖淀粉酶最適pH 緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的淀粉底物， 在最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)量麥芽糖淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Km為0.95 g/L，比酶活為2 646 U/mg。 通過一系列純化操作，將麥芽糖淀粉酶進(jìn)行純化，見圖14，可見麥芽糖淀粉酶已純化至電泳純。

圖14 麥芽糖淀粉酶純化至電泳純Fig. 14 Purification of maltogenic amylase

在最適條件下測(cè)量純化后麥芽糖淀粉酶酶活，并用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，得到麥芽糖淀粉酶比酶活。

3 討 論

麥芽糖淀粉酶在麥芽糖漿的制備中有很好的作用，其具有多底物特異性，對(duì)于麥芽三糖、淀粉及一些寡糖均具有水解作用[20]。 近年來隨著烘焙食品的逐漸發(fā)展，烘焙食品的貯藏周期短是急需要解決的一個(gè)問題。

由于TB 培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富， 較為適合枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)[19]，所以在TB 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。 在本研究中，酵母浸膏和大豆蛋白胨分別作為單一氮源時(shí)， 前者有菌體濃度不高、后者有酶活方面略差的缺點(diǎn)，因此使用酵母浸膏與大豆蛋白胨作為復(fù)合氮源。 相比較初始搖瓶培養(yǎng)溫度，重組菌在41 ℃產(chǎn)酶最好，酶活最高，可能因麥芽糖淀粉酶來自于嗜熱脂肪芽孢桿菌，本身在高溫下酶的折疊性較低溫下好。

經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌中表達(dá)的麥芽糖淀粉酶比在大腸桿菌中的適應(yīng)pH 范圍和溫度范圍都更加廣泛，實(shí)際應(yīng)用時(shí)更有優(yōu)勢(shì)。 在烘焙食品方面，除了麥芽糖淀粉酶，還有一些淀粉酶也可以水解淀粉生成麥芽糖及糊精，但是其最適溫度都存在過低或過高使得在加工過程中及加工過程后滅活的過程中出現(xiàn)問題。 而麥芽糖淀粉酶的最適溫度處于一個(gè)較為適宜的水平，既不會(huì)因?yàn)榧庸み^程中溫度較高而失活， 又能在加工后被有效滅活，不引起淀粉的過度分解致使面團(tuán)發(fā)黏，因此其抗淀粉老化能力較好，可以有效地保持面包的彈性及新鮮程度。 盡管麥芽糖淀粉酶在大腸桿菌中的表達(dá)可高達(dá)4 379 U/mL[9]，但是以大腸桿菌為宿主發(fā)酵生產(chǎn)的麥芽糖淀粉酶不宜用于食品工業(yè)，枯草芽孢桿菌作為一個(gè)具有安全性及分泌潛力的宿主菌，對(duì)產(chǎn)生麥芽糖淀粉酶并用于食品烘焙行業(yè)是非常具有競(jìng)爭(zhēng)力的。

作者采用B.stearothermophilus來源的麥芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過優(yōu)化重組菌的發(fā)酵條件，確定了麥芽糖淀粉酶搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基及溫度等，同時(shí)對(duì)麥芽糖淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的測(cè)量，為其在食品行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 語

將B.stearothermophilus來源的麥芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)， 在TB 培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h 后， 麥芽糖淀粉酶活力可達(dá)250.7 U/mL。 在此基礎(chǔ)上對(duì)重組菌搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定重組菌發(fā)酵最適宜條件為：氮源（酵母浸膏25 g/L，大豆蛋白胨5 g/L）30 g/L、甘油5 g/L、初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度41 ℃。 最佳發(fā)酵條件下麥芽糖淀粉酶酶活可達(dá)396 U/mL。測(cè)定麥芽糖淀粉酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃、最適pH 為5.5，麥芽糖淀粉酶的反應(yīng)溫度和pH 的適應(yīng)范圍都很廣泛、在60 ℃下半衰期為325 h、動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為0.95 g/L、比活為2 646 U/mg，在食品等工業(yè)上都具有良好的應(yīng)用前景。