鎘脅迫下海藻酸鈉與氯化鈣混合添加對黃瓜幼苗鎘吸收的影響

趙戴軍，陳碧華，2，郭衛(wèi)麗，2，潘飛飛，2，孟凡茹，王廣印，2

(1．河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2．河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

近年來，隨著工業(yè)廢棄物的排放、化肥農(nóng)藥的過量使用，導(dǎo)致土壤的鎘(Cd)污染[1-2]。Cd是一種重金屬元素，具有很強(qiáng)的毒性，不僅會危害農(nóng)作物的生長，而且會危害人體的健康[3]，因此土壤Cd污染的治理迫在眉睫。常見的土壤修復(fù)方式有農(nóng)業(yè)修復(fù)、物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)[4]，海藻酸鈉(NaAlg)是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產(chǎn)物[5]，具有性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、無刺激性以及符合要求的粘度、滲透性、親水性、溶解性等特性[6]，所以NaAlg被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[7-10]。NaAlg中的Na+可以與二價陽離子發(fā)生交換，使得NaAlg溶液向凝膠轉(zhuǎn)變[11]。Lee等[12]研究表明，與其他二價陽離子相比Ca2+為最常用的交聯(lián)劑。鄧靖等[13]研究表明，與其他鈣劑相比CaCl2是一種理想的交聯(lián)劑。NaAlg被應(yīng)用于治理重金屬水污染的報(bào)道較多，且效果顯著[14]，但NaAlg被用于土壤Cd污染治理的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以蔬菜種植面積較大的黃瓜(CucumissativusL.)為試驗(yàn)材料，研究基質(zhì)中NaAlg與CaCl2混合添加對鎘脅迫下黃瓜幼苗鎘吸收的影響。旨在通過NaAlg與CaCl2協(xié)同作用減少黃瓜幼苗對重金屬Cd的吸收利用，從而減少Cd2+通過食物鏈對人體的危害，為Cd污染的治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜種子為‘新津春4號’，由寧陽縣魯明種子有限公司提供。

試劑：海藻酸鈉(NaAlg)(山東西亞化學(xué)股份有限公司)；無水氯化鈣(CaCl2)(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年11月在河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院進(jìn)行，盆栽試驗(yàn)采用基質(zhì)栽培，基質(zhì)按草 炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的體積比配制，基質(zhì)中采用CdCl2·2.5H2O進(jìn)行鎘脅迫，脅迫含量為20 mg·kg-1，按NaAlg和CaCl2添加量共設(shè)置對照(CK)、T50、T100、T200、T400、T8006個處理，每個處理6盆，重復(fù)3次，共108盆。如表1所示，將基質(zhì)攪拌均勻使含水量達(dá)到70%，將基質(zhì)裝入規(guī)格為6 cm×6 cm×7.5 cm的營養(yǎng)缽中。將黃瓜種子進(jìn)行溫湯浸種，55 ℃水溫下攪拌15 min，放置在常溫水中浸種4 h，然后將種子播種到營養(yǎng)缽中進(jìn)行培養(yǎng)(每個營養(yǎng)缽中種1株黃瓜)。

表1 各處理CdCl2·2.5H2O、NaAlg和CaCl2添加量Table 1 Addition amount of CdCl2·2.5H2O, NaAlg and CaCl2

注： Wt為溶液的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(溶質(zhì)質(zhì)量/溶液質(zhì)量)。

Note:Wt in the table is mass percentage of solution (solute mass/solution mass).

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生長指標(biāo)的測定 待黃瓜幼苗長至2片真葉時，用卷尺、游標(biāo)卡尺、手持葉綠素儀(SPAD-502)分別測定每棵黃瓜幼苗的株高、莖粗、葉片數(shù)以及葉綠素含量。

每個處理的每個重復(fù)中分別取1株黃瓜幼苗，將黃瓜幼苗的地上部和根分別放入烘箱中，先105 ℃殺青30 min，然后于70 ℃烘至恒量，用電子分析天平分別稱取烘干前后的鮮質(zhì)量及干 質(zhì)量。

每個處理的每個重復(fù)中分別取1株黃瓜幼苗，將完整的黃瓜幼苗根從基質(zhì)中取出、洗凈，用根系掃描儀(Epson Perfection V800)進(jìn)行掃描，然后用WinRHIZO根系形態(tài)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，獲取總根長、根表面積、根系平均直徑、根體積和根尖數(shù)等根系形態(tài)參數(shù)。

1.3.2 黃瓜幼苗鎘含量的測定 每個處理的每個重復(fù)中分別取1株黃瓜幼苗，將其根、莖、葉分別烘干、磨碎，各稱取0.2 g(精確至0.001 g)，在消解罐中加8 mL濃硝酸、2 mL高氯酸和2 mL雙氧水，置于消解儀中[165 ℃ 5 W(機(jī)器運(yùn)行功率)]，消解至澄清、無雜質(zhì)，后將消解完成的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的聚四氯乙烯燒杯中，在電熱板上(170 ℃)趕酸至近干，然后用含量為 0.5%的硝酸定容至25 mL，定容結(jié)束后將溶液裝入50 mL離心管中待測，Optima 2100 DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定樣品中的鎘含量[15]。

1.3.3 黃瓜幼苗中亞細(xì)胞組分分離與分析 參照宋阿琳等[16]方法，略有改進(jìn)。從每個處理的每個重復(fù)中分別取1株黃瓜幼苗，分別取其地上部分與地下部分，各稱取0.5 g在研缽中，加入5 mL的勻漿液[成分：蔗糖250 mmol·L-1，Tris-HCl(pH 7.5)50 mmol·L-1和DTT 1 mmol·L-1]，4 ℃下研磨，轉(zhuǎn)移至離心管中，3 000 r·min-1離心1 min，沉淀為細(xì)胞壁成分。取上清液繼續(xù)進(jìn)行離心，14 500 r·min-1離心45 min，沉淀為細(xì)胞器，上清液為細(xì)胞質(zhì)。將離心后的細(xì)胞壁和細(xì)胞器組分再進(jìn)行消解，并用質(zhì)量比為0.5%的稀硝酸定容至25 mL，細(xì)胞質(zhì)組分直接定容到容量瓶中待測。

1.3.4 膜保護(hù)酶活性測定 從每個處理的每個重復(fù)中取黃瓜幼苗的全部真葉，剪碎(去葉脈)，取0.5 g放入研缽中加入5 mL 62.5 mmol·L-1pH 7.8 PBS(含量為0.3%的PVP)和少量的石英沙，于冰浴研磨成勻漿，15 000 g，4 ℃低溫離心10 min，上清液于4 ℃低溫保存，備用。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT))方法測定[17]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚方法測定[18]，過氧化氫酶(CAT)活性采用H2O2方法測定[19]。

1.3.5 丙二醛(MDA)含量測定 酶液的提取見“1.3.4”。MDA含量采用硫代巴比妥酸的方法測定[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗生長變化

2.1.1 黃瓜幼苗莖粗、株高、葉片數(shù)及葉綠素含量的變化 由表2可知，T50處理下黃瓜幼苗的莖粗達(dá)到最大值，T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的莖粗較CK分別增加25.30%、 23.69%、17.67%、18.09%和12.45%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T100處理下黃瓜幼苗的株高達(dá)到最大值，T50、T100、T200處理下黃瓜幼苗的株高較CK分別增加10.95%、13.26%和10.66%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加黃瓜幼苗的葉片數(shù)呈下降趨勢，T50和T100處理下黃瓜幼苗的葉片數(shù)較CK差異不顯著(P>0.05)，T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的葉片數(shù)較CK分別降低21.60%、 30.52%和38.97%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T800處理下黃瓜幼苗的葉綠素含量達(dá)到最大值，T800處理下黃瓜幼苗的葉綠素含量較CK增加 12.14%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，T50、T200和T400處理下黃瓜幼苗的葉綠素含量較CK差異不顯著(P>0.05)。

表2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗莖粗、株高、葉片數(shù)及葉綠素含量Table 2 Stem thickness, plant height, number of blades and chlorophyll content of cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同一列不同小寫字母分別表示不同處理之間在0.05水平存在顯著性差異。下同。

Note:The data in the table is the “average ± standard error”；and different lowercase letters in the same column indicate significant differences at 0.05 levels among different treatments.The same below.

2.1.2 黃瓜幼苗干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的變化 由表3可知，T200處理下黃瓜幼苗的地上部鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的地上部鮮質(zhì)量較CK分別增加32.05%、 43.25%、50.04%、27.64%和29.35%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T200處理下黃瓜幼苗的地下部鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，T200處理下黃瓜幼苗地下部鮮質(zhì)量較CK增加24.40%，達(dá)到顯著水平 (P<0.05)，而T800處理下黃瓜幼苗的地下部鮮質(zhì)量較CK則減少37.80%，達(dá)到顯著水平(P< 0.05)；T200處理下黃瓜幼苗的地上部干質(zhì)量達(dá)到最大值，T50、T100、T200、T400處理下黃瓜幼苗的地上部干質(zhì)量較CK分別增加27.69%、23.85%、 29.23%和15.38%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T100、T200處理下黃瓜幼苗的地下部干質(zhì)量均達(dá)到最大值，T100、T200處理下黃瓜幼苗的地下部干質(zhì)量較CK分別增加9.52%，T800處理下黃瓜幼苗的地下部干質(zhì)量較CK減少33.3%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表3 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗單株干質(zhì)量和鮮質(zhì)量Table 3 Dry mass and fresh mass of cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

2.1.3 黃瓜幼苗根系形態(tài)的變化 由表4可知，T50處理下黃瓜幼苗的根總長達(dá)到最大值，較CK增加32.97%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，T400、T800處理下黃瓜幼苗的根總長較CK分別降低33.26%、 78.31%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T50處理下黃瓜幼苗的根表面積達(dá)到最大值，較CK增加32.97%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，T400、T800處理下黃瓜幼苗的根表面積較CK分別降低20.92%、72.42%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T800處理下黃瓜幼苗的根平均直徑達(dá)到最大值，T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的根平均直徑較CK分別增加11.54%、 15.38%、23.08%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；T50處理下黃瓜幼苗的根體積達(dá)到最大值，T50、T200處理下黃瓜幼苗的根體積較CK分別增加 39.39%、33.33%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，T800處理下黃瓜幼苗的根體積較CK降低 63.64%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；CK處理下黃瓜幼苗的根尖數(shù)達(dá)到最大值，T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的根尖數(shù)較CK降低43.61%、 65.26%、69.51%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表4 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗根系形態(tài)Table 4 Root morphology of cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

2.2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+積累的變化

黃瓜幼苗中的Cd2+主要集中在根系中，而莖、葉中的鎘含量未檢出。由表5可知，T200處理下黃瓜幼苗根Cd2+含量達(dá)到最小值，較CK減少 9.375%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，T100、T400、T800處理下黃瓜幼苗根Cd2+含量較CK分別增加21.79%、27.49%、104.02%，達(dá)到顯著水平 (P<0.05)。

表5 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+積累Table 5 Cd2+ accumulation of cucumber seedlings under with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 Cd stress

2.3 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+亞細(xì)胞分布的變化

隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加，Cd2+脅迫下黃瓜幼苗地上部細(xì)胞壁、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)以及地下部細(xì)胞器中的Cd2+含量均無檢出；而地下部細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的Cd2+含量均呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢。由表6可知，CK、T50、T100、T200、T400處理下黃瓜幼苗地下部亞細(xì)胞組分Cd2+含量均呈現(xiàn)細(xì)胞壁>細(xì)胞質(zhì)>細(xì)胞器，而T800處理下地下部亞細(xì)胞組分Cd2+含量呈現(xiàn)細(xì)胞液>細(xì)胞壁>細(xì)胞器。T200處理下地下部細(xì)胞壁的Cd2+含量較CK降低31.82%，差異性不顯著 (P>0.05)，T400和T800處理下地下部細(xì)胞壁的Cd2+含量較CK分別增加277.68%和428.57%，達(dá)到顯著水平(P< 0.05)。

表6 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+亞細(xì)胞分布Table 6 Distribution of Cd2+ cells in cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

注：“─”表示Cd2+含量未檢出。

Note:“─” indicates the Cd2+content has not been detected.

2.4 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗膜保護(hù)酶活性的變化

由圖1-A可知，T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗SOD活性較CK差異不顯著(P>0.05)；由圖1-B可知，POD活性隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，T400處理下黃瓜幼苗POD活性達(dá)到最大值。T100、T200、T400處理下黃瓜幼苗POD活性較CK分別增加41.79%、32.31%、115.61%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；由圖1-C可知，CAT活性隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，T200處理下黃瓜幼苗CAT活性達(dá)到最大值。T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗CAT活性較CK分別增加40%、106.67%、 113.33%、73.33%、86.67%，達(dá)到顯著水平 (P<0.05)。

圖中不同小寫字母表示不同處理之間在0.05水平存在顯著性差異。下同

Different lowercase letters in the figure indicate significant differences among the different treatments at the 0.05 level. The same below

圖1 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗抗氧化酶活性
Fig.1 Activities of antioxidant enzymes in cucumber seedlings with use of mixed NaAlg and CaCl2under Cd stress

2.5 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗MDA含量的變化

如圖2所示，MDA含量隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，T400處理下黃瓜幼苗MDA含量達(dá)到最小值。T100、T200、T400和 T800處理下黃瓜幼苗MDA含量較CK分別減少26.76%、29.82%、46.42%和 20.74%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

圖2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗MDA含量Fig.2 MDA content in cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

3 討 論

3.1 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗生長的影響

黃瓜是中國主栽蔬菜品種之一[21]，以黃瓜為試驗(yàn)材料能更好地反應(yīng)NaAlg對土壤Cd污染修復(fù)效應(yīng)。張振華等[22]研究表明鹽脅迫條件下植株相關(guān)生理指標(biāo)的高低可直接反應(yīng)出植株耐鹽脅迫能力的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)表明，在T50、T100、T200處理下黃瓜幼苗的株高、莖粗顯著增加，表明在這3個處理水平下黃瓜幼苗的耐Cd脅迫能力增強(qiáng)。葉綠素含量能表示植物在脅迫條件下光合作用的強(qiáng)弱[23]，本試驗(yàn)表明，隨著NaAlg和CaCl2混合添加量的增加，黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢，表明黃瓜幼苗光合作用的能力先減弱再增強(qiáng)，在T800處理下葉綠素含量最高，可能是形成老化苗的原因[24]，表明單純的憑葉綠素含量的高低并不能反映植株生長的好壞。生物量降低是鎘脅迫下植物最敏感的生理響應(yīng)[25]，本試驗(yàn)表明，地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根干質(zhì)量在T200處理下均達(dá)到最大值，表明在T200處理下黃瓜幼苗受到Cd2+的毒害作用最小。根系對地上部生長有重要影響[26]。本試驗(yàn)表明，少量NaAlg和CaCl2混合添加會促進(jìn)黃瓜幼苗根系生長，隨著NaAlg和CaCl2混合添加量的增加，黃瓜幼苗根系生長受到抑制，這與張瑛等[27]、李繼光等[28]、任艷芳等[29]研究結(jié)果基本一致。

3.2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗Cd2+積累及亞細(xì)胞分布的影響

Cd2+在植物組織的亞細(xì)胞分布特點(diǎn)，有助于更好地了解植物耐Cd2+機(jī)制[30]，彭秋等[31]研究表明辣椒細(xì)胞壁在Cd2+的區(qū)隔和抗性中起重要作用，鄒圓等[32]研究表明隨著Cd2+含量的增加細(xì)胞壁的鎘含量顯著增加，本試驗(yàn)表明，黃瓜幼苗地上部亞細(xì)胞Cd2+含量無檢出，黃瓜根系Cd2+的亞細(xì)胞分布總趨勢為細(xì)胞壁>細(xì)胞液>細(xì)胞器，T200處理水平下根系細(xì)胞壁的Cd2+含量達(dá)到最小值，T800處理時根系細(xì)胞壁的Cd2+含量達(dá)到最大值，而此時的根系細(xì)胞液的Cd2+含量大于細(xì)胞壁的Cd2+含量，Sharma等[33]研究表明高含量的重金屬脅迫會造成根系細(xì)胞壁透性增大，細(xì)胞壁對重金屬的截留能力喪失，使得重金屬離子向細(xì)胞內(nèi)遷移，這與本試驗(yàn)研究一致。植物體內(nèi)的重金屬含量和積累量是評價植物修復(fù)效果好壞的最直接指標(biāo)[34]，本試驗(yàn)研究表明，黃瓜幼苗中的Cd2+主要集中在根系中，莖、葉中的Cd2+含量較少。T200處理水平下根系Cd2+含量達(dá)到最小值，隨著NaAlg和CaCl2添加量的增加，根系的Cd2+含量也逐漸增加，這與施辰陽等[35]研究結(jié)果一致。

3.3 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗膜保護(hù)酶活性及MDA含量的影響

抗氧化酶活性可以反映植物膜系統(tǒng)受損傷程度，SOD、POD和CAT均是植物受逆境脅迫時起防御作用的重要保護(hù)酶[36]，MDA作為植物體細(xì)胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，在植物體受到外界鹽堿等逆境時，其含量會升高[37]。本試驗(yàn)研究表明，隨著NaAlg和CaCl2添加量的增加，POD和CAT活性顯著增加，SOD活性的變化不顯著，MDA含量顯著減小，表明隨著NaAlg和CaCl2添加量的增加，黃瓜幼苗受到Cd2+的傷害程度顯著降低，這與楊若鵬等[38]的研究一致。