1 株兔肺源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥分析

侯 景，楊澤曉，趙 位，王 翔，晏仕強

( 四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，成都 611130)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為一種存在廣泛并耐藥性嚴重的人獸共患病原菌，在臨床上主要引起創(chuàng)傷、呼吸道黏膜、消化道黏膜、內(nèi)臟表面以及血液感染，形成化膿灶、腹膜炎和菌血癥等臨床癥狀，主要導致創(chuàng)口久不愈合、腹水與急性死亡[1]。在獸醫(yī)臨床上，兔金黃色葡萄球菌病是由金黃色葡萄球菌感染引起，主要表現(xiàn)為兔致死性傳染病和全身各器官膿腫，有的死兔出現(xiàn)肝臟腫大，有明顯的壞死灶，膽囊腫大，膽汁濃稠，脾臟腫大[2]，在生產(chǎn)上影響極大。2018年12月某養(yǎng)兔場送檢一批病死兔只，經(jīng)臨床癥狀、剖檢病變，初診為金黃色葡萄球菌感染，為探索此次送檢病死兔病原菌的生物學特性，本研究無菌采集肺臟化膿灶進行細菌分離和純化，通過染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化試驗、動物致病試驗和分子生物學技術對分離株進行鑒定，并對分離菌株進行藥敏試驗和16S rDNA序列分析[3]，以及定性基因femb[4]、β內(nèi)酰胺類耐藥基因meca、氨基糖苷修飾酶基因aph(3′)-III、aac(6′)/aph(2′)、ant(4′,4′′)[5]、萬古霉素耐藥基因plw043鑒定，以期為金黃色葡萄球菌病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料 成都市某兔場送檢到四川農(nóng)業(yè)大學動物檢疫實驗室的患病兔。

1.1.2 主要材料 營養(yǎng)瓊脂購自青島高科技工業(yè)園博海生物技術有限公司；血清購自成都市科隆化學品有限公司，氨芐西林、青霉素、頭孢哌酮、妥布霉素、紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、萬古霉素等19種抗生素標準藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；1×TaqMaster Mix、DL2000 DNA marker購自成都擎科生化科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；試驗小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.3 PCR擴增引物 參照文獻[3-5]設計擴增金黃色葡萄球菌16S rDNA基因、特異性基因femb、常見耐藥基因的引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 細菌分離純化 無菌采集肺部化膿性灶，劃線接種于血清瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取光滑、濕潤的單菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 生化試驗 挑取經(jīng)典的光滑、濕潤的單菌落進行酶觸試驗，分別接種于乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇等發(fā)酵管進行生化鑒定[6]， 37 ℃培養(yǎng)24～48h后觀察顏色變化。

1.2.3PCR鑒定與耐藥基因檢測 參照文獻[3-5]，提取分離菌株基因組DNA，使用表1中引物進行16SrDNA、金黃色葡萄球菌femb基因和常見耐藥基因的PCR擴增。PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并取特異性擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對[7]。

1.2.4 藥敏試驗 將鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株接種于普通瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，參照紙片擴散法對菌株進行藥物敏感性試驗，參照WS/T125-1999《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》讀取結果并進行判定。

1.2.5 小鼠攻毒試驗 用2mL滅菌生理鹽水將過夜培養(yǎng)平板上的細菌沖洗下來，裝入無菌離心管，將菌液濃度調(diào)至2.2×1011cfu/mL，將20只小鼠隨機分為2 組，雌雄各半，試驗組腹腔注射菌液0.2mL，另一組腹腔注射0.2mL生理鹽水(對照組)，然后記錄小鼠死亡情況，同時對死亡小鼠進行剖檢，并取下肺、肝、心、脾組織，在血清瓊脂平板上進行細菌分離純化和染色鏡檢。

2 結果與分析

2.1 兔肺源金黃色葡萄球菌的分離

由圖1可見，分離菌株為雙球或短鏈狀排列的G+細菌。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)(A)與革蘭染色結果(B)Fig.1 Colony morphology(A) and gram staining results(B)

2.2 生化試驗

該分離菌株可發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，與金黃色葡萄球菌生化特性結果 相符。

2.3 分離菌株PCR鑒定

16S rDNA PCR擴增得到大小為1 445 bp的條帶(圖2)，測序后在線比對結果顯示，該分離菌株16S rDNA與S.aureusJ Mub 3031菌株16S rDNA基因序列相似性為99%。金黃色葡萄球菌特異性基因femb擴增出約825 bp的特異性條帶(圖2)，測序后對比發(fā)現(xiàn)，與S.aureus22_LA_562菌株femb基因的序列相似性為100%。因此鑒定該分離菌株為金黃色葡萄球菌，并命名為S.aureusR18。

5種耐藥基因meca、aac(6′)/aph(2′)、aph(3′)-III、ant(4′，4′′)和plw043的PCR擴增結果顯示，耐藥基因特異性片段均被擴增到，且與預期大小相符(圖2)，測序后在線比對，結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應的耐藥基因序列完全一致。

2.4 藥敏試驗

由表2可知，金黃色葡萄球菌分離株S.aureusR18僅對頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢噻吩、哌拉西林4種藥物敏感，對其他15種藥物均耐藥。該菌株在受試的19種抗菌藥中耐藥率高達78%，與耐藥基因PCR檢測結果比較發(fā)現(xiàn)，該菌株耐藥的表現(xiàn)型與基因型相符。

M.DL2000 DNA marker;1.16S rDNA;2.femb;3.meca; 4.aac(6′)/aph(2′);5.aph(3′)-III;6.ant(4′，4′′);7.plw043

圖2 分離菌株的 16S rDNA、femb基因和耐藥基因PCR檢測結果
Fig.2 PCR results ofStaphylococcusaureus16 s rDNA,fembgene, and drug-resistance gene

2.5 小鼠致病性試驗

小鼠致病性試驗結果顯示，試驗組小鼠3 d內(nèi)全部死亡；對照組小鼠均正常。取試驗組死亡小鼠進行細菌分離鑒定，得到與接種菌相同的金黃色葡萄球菌。表明該分離菌株對小鼠具有較強的致病性。

表2 分離菌株藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity of S.aureus

3 討 論

金黃色葡萄球菌是一種重要的人畜共患病原菌，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染，在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可檢測到，其致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。其ClfA、FnBP等毒力因子在細菌感染過程中有重要作用[8]。該菌對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧。平板上的菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0.5～1.0 mm，其中0.8 mm左右的菌落致病性最強，且具有致病性的金黃色葡萄球菌菌株可以分解甘露醇，在本研究中，分離菌株的形態(tài)學培養(yǎng)特性和生化特性都與典型的金黃色葡萄球菌一致，動物試驗也證實，分離的金黃色葡萄球菌菌株S.aureusR18對小鼠具有較強的致 病性。

用16S rDNA擴增及序列分析法對分離菌進行鑒定，提高原來主要靠染色鏡檢和生化試驗進行細菌鑒定的結果準確性，目前已經(jīng)成為細菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列[9]。然而作為編碼原核生物16S rDNA的基因，由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成，保守區(qū)為所有細菌共有，無顯著差異；可變區(qū)則具有細菌的種、屬特異性。因此，本研究在用16S rDNA 進行鑒定的同時，又引入金黃色葡萄球菌femb基因的PCR檢測。結果顯示，分離菌株16S rDNA與公布的S.aureus菌株16S rDNA的同源性超過99 %，S.aureusR18的femb基因序列與其他金黃色葡萄球菌的同源性為100%。

耐藥性金黃色葡萄球菌因具有較強的定植能力和外界環(huán)境適應能力，在全球范圍內(nèi)迅速傳播。據(jù)報道，實踐中耐藥性金黃色葡萄球菌的檢出率從1980年的20%迅速升至2008年的約 60%[10]。尤其20世紀80年代報道發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌( MRSA )以來，MRSA對慶大霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素和利福平的耐藥率均達70 %以上[11]。陳瑤等[12]在重慶部分養(yǎng)殖場對5株豬源菌株、32株雞源菌株、6株牛源菌株、l0株羊源菌株和16株兔源菌株分析顯示，金黃色葡萄球菌都具有多重耐藥特性。耐藥性的產(chǎn)生使金黃色葡萄球菌的敏感藥物防治成為關注熱點，萬古霉素成為用于金黃色葡萄球菌感染治療的主要藥物，也取得理想的療效。萬古霉素是由一種鏈霉菌產(chǎn)生、結構復雜的糖肽類抗菌藥物，專一抑制肽聚糖的生物合成。臨床上主要用于耐藥菌感染的治療，可抑制革蘭氏陽性菌細胞壁的合成，對金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等作用良好[13]。然而耐受萬古霉素的菌株很快也被發(fā)現(xiàn)。2018年，張士法等[14]在胸外科患者術后醫(yī)院感染病原學特點及藥敏分析研究中報道，受檢金黃色葡萄球菌具有多重耐藥，且對萬古霉素的耐藥率達到100%。Bhargava等[15]研究的67株金黃色葡萄球菌均對青霉素均耐藥，所有分離菌株都對β-內(nèi)酰胺酶、紅霉素、四環(huán)素、林可霉素、慶大霉素和利福平的耐藥率接近或超過60 %。本研究分離鑒定的兔源S.aureusR18菌株也具有嚴重的多重耐藥現(xiàn)象，除對頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢噻吩、哌拉西林4種藥物敏感外，其他15種受試的藥物全部耐藥，也包括萬古霉素高度耐受，耐受藥物比例高達 78%。耐藥基因檢測結果顯示，受檢的5種耐藥基因全部陽性，其具體耐藥性產(chǎn)生的機制還需要進一步研究。

本研究通過常規(guī)細菌分離鑒定技術和PCR鑒定從新近發(fā)生臨床感染的兔病例中分離到1株對小鼠具有較強致病性且具有嚴重多重耐藥性的金黃色葡萄球菌，研究結果不僅為該病的臨床診治提供可靠的參考依據(jù)，而且為金黃色葡萄球菌的耐藥機制研究提供試驗材料。