基于石墨烯納米材料的DNA測序研究進(jìn)展

鄭梅瓊，林佳敏，侯曉琳，聶 彤，黃曉欣，楊劍萍

(廣東第二師范學(xué)院 化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

DNA測序指分析特定DNA片段中的堿基序列即腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的排列方式。堿基的排列順序包含了大量的生物信息和遺傳指令，不僅在基因診斷、基因治療、揭示遺傳信息、調(diào)控基因表達(dá)等基礎(chǔ)生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用，而且在國民經(jīng)濟(jì)、安全、軍事、法律等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。DNA測序是準(zhǔn)確快速讀取堿基序列的方法[1]。研發(fā)高效的DNA測序方法進(jìn)行生物基因組數(shù)據(jù)分析，在早期疾病的診斷和治療，了解相關(guān)疾病的病理，尤其是促進(jìn)個體化醫(yī)療，最終達(dá)到預(yù)防疾病等方面具有非常重要的意義。

根據(jù)已報道的DNA測序方法，可以將其分為四代：第一代為熒光標(biāo)記Sanger測序法[2-3]；第二代是循環(huán)陣列合成測序法[4]；第三代是單分子測序法[5]；第四代是納米孔測序法[6]。與前三代基因測序技術(shù)相比,第四代基因測序技術(shù)在成本、速度、檢測長度和儀器小型化等方面有著很大提高，并且實現(xiàn)了從光學(xué)檢測到電信號檢測的轉(zhuǎn)變。基于納米孔的測序技術(shù)是一種無標(biāo)簽、無放大、單分子的高通量DNA分析方法[1]，是目前最有前途和最具革命性的DNA測序技術(shù)之一，并且有望達(dá)到黃金標(biāo)準(zhǔn)以上的水平，具有價格低廉、可靠、通量高等特點。

石墨烯是單層碳原子，呈二維六角形格子狀排列，具有原子薄，強(qiáng)度大，靈活度高，可拉伸和呈透明狀，光學(xué)性能可調(diào)節(jié)，離子不可穿透等優(yōu)點，同時還是優(yōu)良的熱導(dǎo)體和導(dǎo)電體[2]。其巨大的比表面積(高達(dá)2 630 m2/g)和獨(dú)特的sp2雜化碳的蜂窩狀晶格，使之成為生物分子錨定和檢測的理想候選材料。除此之外，石墨烯特別適合DNA測序，因為單層石墨烯的厚度可以達(dá)到0.35 nm，與ssDNA中相鄰核苷酸間的距離(0.32～0.52 nm)[7]相近。再者，石墨烯納米孔的尺寸可以精確制作并調(diào)整到大約1.0 nm，近似于DNA分子的大小。理論研究表明，在合適的石墨烯中采用橫跨膜電導(dǎo)的測序方法可以實現(xiàn)錯誤率為零的DNA測序[7]。石墨烯上述優(yōu)異性能使之成為制備生物傳感器的理想材料并廣泛應(yīng)用于DNA測序領(lǐng)域。本文側(cè)重論述了近年來石墨烯納米孔、納米間隙、納米帶在DNA測序方面的最新研究進(jìn)展(圖1)。當(dāng)DNA分子在外加電場的作用下穿過石墨烯納米孔時，研究人員通過分析離子電流的變化可以獲得堿基順序(圖1A)。石墨烯納米間隙測序法則是利用石墨烯的導(dǎo)電性(圖1B)，因為當(dāng)DNA分子中的每個堿基流經(jīng)石墨烯納米間隙時會產(chǎn)生不同的隧穿電流。石墨烯納米帶測序法通過監(jiān)控DNA分子通過孔隙時產(chǎn)生的不同的橫向電流(圖1C)進(jìn)行測定。

圖1 應(yīng)用石墨烯納米材料的DNA測序法[8]Fig.1 DNA sequencing methods using graphene nanomaterials[8]A.the modulations of ionic current by DNA molecule through graphene nanopore;B.variations in tunnelling current by DNA molecule through graphene nanogap;C.the changes of in-plane current by DNA molecule through graphene nanoribbon(A.DNA分子通過石墨烯納米孔引起離子電流的變化；B.DNA分子通過石墨烯納米間隙引起隧穿電流的變化；C.DNA分子通過石墨烯納米帶引起橫向電流的變化)

1 石墨烯納米孔測序法

石墨烯納米孔測序法原理是基于DNA分子中的每個堿基以稍微不同的方式阻斷離子電流通過石墨烯薄片上的微小納米孔，即根據(jù)DNA分子堿基的大小和形狀不同，產(chǎn)生不同的特征離子電流信號，從而檢測DNA分子序列。方法是將帶納米孔的不滲透膜插入到兩個獨(dú)立的電解溶液池之間，對膜兩側(cè)施加電壓，檢測孔隙中的離子電流。由于DNA的磷酸骨架帶有強(qiáng)烈的負(fù)電荷，因此可在電場存在下，使DNA以從頭到尾的方式通過納米孔。當(dāng)DNA分子通過納米孔道時，堿基會阻斷離子的流通，形成阻斷電流。每個阻斷電流的傾角代表一個生物分子的通路，脈沖的大小和持續(xù)時間分別表示分子的半徑和長度[9]。

利用石墨烯納米孔進(jìn)行DNA測序的優(yōu)勢在于，單層石墨烯的離子滲透能力很弱，并且由于其柔韌性，石墨烯可以形成獨(dú)立的膜，促進(jìn)理想原子薄膜形成。由于經(jīng)過離子篩選后，溶液中石墨烯的有效厚度僅約0.6 nm，這與單鏈DNA分子中兩個相鄰堿基之間的距離(約0.6 nm)相同[8]，因此單層石墨烯的感測分辨率具有達(dá)到理論最優(yōu)的潛力。另一方面，石墨烯具有優(yōu)良的導(dǎo)電性，可以實時監(jiān)測DNA分子通過孔隙的電流。英國Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司推出了實時快速檢測DNA和RNA的便攜式測序儀MinION[10]。該儀器由一個傳感器芯片、專用集成電路和適配器組成。該儀器主要是通過測量DNA片段通過納米孔時產(chǎn)生的電導(dǎo)率變化來識別DNA堿基。由于納米孔道在同一時間內(nèi)含多個堿基，且該裝置系統(tǒng)誤差較大，進(jìn)而導(dǎo)致測定結(jié)果準(zhǔn)確率降低。但在石墨烯納米孔隙的體積中離子信號只源于一個或幾個相鄰的堿基，因此信號處理可高度簡化。

研究人員對離子電流通過石墨烯納米孔以用于DNA測序的可行性進(jìn)行理論研究[11-12]，利用分子動力學(xué)模擬DNA分子通過石墨烯納米孔的運(yùn)動，以便確定離子電流影響DNA測序的方式。早期的研究發(fā)現(xiàn)，在1 V的偏置電壓下石墨烯納米孔可以區(qū)分聚AT堿基對和聚GC堿基對，但同時也發(fā)現(xiàn)了以下問題：DNA分子中每個堿基通常以0.01～1.00 μs的速度穿過孔隙，其速度太快，且易受到離子電流中高噪聲的限制[13]，這導(dǎo)致電流阻塞，出現(xiàn)強(qiáng)烈的信號重疊，致使無法區(qū)分每一個堿基。因此，理想的DNA測序應(yīng)該是找到一種方法來控制ssDNA通過納米孔道的速度。Shankla等[14]采用全原子分子動力學(xué)(MB)方法，發(fā)現(xiàn)在中性電荷膜中，ssDNA的平均移位速度為0.06 nt/ns，且通過納米孔道的速度隨著電荷密度的增加而增加，在電荷密度1 e/nm2時達(dá)到0.25 nt/ns。Shankla采用帶正電荷(電荷密度為1.5 e/nm2)的三層石墨烯膜，在500 mV的偏置電壓下，觀察到約7個核苷酸通過納米孔，當(dāng)膜電荷密度為-1.5 e/nm2時，核苷酸停止通過納米孔道[14]，即膜的負(fù)電荷密度抑制了ssDNA通過納米孔道。故石墨烯電荷可以控制ssDNA通過納米孔的速度。Avdoshenko等[15]采用分子動態(tài)模擬和電子傳輸計算，確定了電場強(qiáng)度和通過納米孔道時間的關(guān)系，證實石墨烯納米孔對DNA核酸堿基具有選擇性(圖2)。這表明DNA的存在會給沿納米孔軸分布的靜電勢帶來微小的擾動并且這個擾動與核酸堿基通過孔道的時間以及種類有關(guān)。

圖2 DNA分子通過石墨烯納米孔的裝置圖(A)和俯視圖(B)[15]Fig.2 Schematic(A) and the top view(B) of DNA molecule through graphene nanopore device[15] the arrow shows how DNA molecule is rotated on the core of the nanopore(箭頭表示DNA分子在納米孔中心的旋轉(zhuǎn)情況)

ssDNA構(gòu)象與石墨烯膜電荷的符號和大小以及DNA鏈的核苷酸組成密切相關(guān)。在電中性石墨烯中，ssDNA的堿基在石墨烯表面上呈平面構(gòu)象。膜電荷密度在0～-2 e/nm2范圍內(nèi)，DNA的磷酸骨架和負(fù)電荷石墨烯表面之間的靜電斥力占主導(dǎo)地位。膜電荷密度為+2 e/nm2時，ssDNA堿基與石墨烯平面形成約47°角，而磷酸骨架仍然平躺在石墨烯平面上[14]。ssDNA分子由平面構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)閮A斜構(gòu)象的動力為靜電作用：帶負(fù)電的磷酸骨架與帶正電的石墨烯納米層相互吸引，導(dǎo)致堿基傾斜，而堿基傾斜有利于偶極矩的靜電能降至最低[14]。除此之外，Shankla還發(fā)現(xiàn)胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、甲基化胞嘧啶和腺嘌呤核苷酸的均聚物在相同電荷密度的石墨烯表面呈現(xiàn)不同的構(gòu)象[14]。

石墨烯薄膜具有柔韌性，這意味著可以使用電子束在懸浮的石墨烯薄片上雕刻納米孔。然而，利用石墨烯納米孔進(jìn)行DNA測序，還需要解決很多基礎(chǔ)性問題。第一，雖然完整的石墨烯薄膜與含有納米孔的薄膜相比，其離子滲透率可以忽略不計，但其值不是零，即不同陽離子的離子滲透率不同，因此需考慮電解質(zhì)-石墨烯的相互作用。第二，有關(guān)石墨烯納米孔維度的問題，一般認(rèn)為該孔是一個有限長度的圓柱體(電導(dǎo)與直徑的平方成正比)，但其卻是一個無限小的圓形孔徑(電導(dǎo)與直徑成正比)。第三，根據(jù)實驗中要進(jìn)行穿孔實驗的單鏈DNA或雙鏈DNA，明確特定納米孔的直徑范圍以及精確制備納米孔。此外，還涉及如何降低電流噪聲，提高信噪比的問題，以及在不增加其他噪聲的情況下，降低DNA通過納米孔道的速度等。

2 石墨烯納米間隙測序法

石墨烯納米間隙測序基于DNA分子中的每個堿基流經(jīng)石墨烯納米間隙時的隧穿電流不同進(jìn)行測定[16]。隧穿電流通過納米間隙電極檢測DNA的方法是：測量穿過兩個緊密間隔的石墨烯納米間隙電極的隧穿電導(dǎo)，監(jiān)測當(dāng)DNA分子通過狹縫時電流的變化。當(dāng)堿基分子能級落在兩個電極的偏置電壓內(nèi)時，可觀察到獨(dú)特的隧穿電流。除此之外，石墨烯可以同時代表膜和電極，并且納米孔和電極在同一平面上會自動對準(zhǔn)，故可大大減少器件制備的工作。

Zhang等采用密度泛函理論-非平衡格林函數(shù)(DFT-NEGF)研究了鋸齒狀石墨烯納米帶的間隙，發(fā)現(xiàn)石墨烯納米窄帶具有完美曲折邊緣的納米結(jié)構(gòu)，可用于預(yù)測并鑒別不同堿基[17]。但另一項研究表明，由于堿基的旋轉(zhuǎn)可能會發(fā)生量子干涉效應(yīng)[18]，導(dǎo)致DNA堿基的離散能量狀態(tài)和石墨烯電極的連續(xù)能態(tài)之間能量耦合而引起Fano型共振，故只有鳥嘌呤可以與腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶區(qū)別開來。

圖3 飛秒激光照射石墨烯納米間隙誘發(fā)產(chǎn)生亞循環(huán)電子脈沖示意圖[22]Fig.3 Schematic of femtosecond laser irradiate the graphene nanogap inducing subcycle electron pulse[22]

隧穿電流對距離和方向的變化具有指數(shù)敏感性，科學(xué)家們預(yù)期隧穿電流會發(fā)生大幅波動[7,18-20]。雖然，4個DNA堿基隧穿電流的預(yù)測分布較寬(多個數(shù)量級的變化)，但幾乎沒有重疊，因此，通過氫化或附著其中一個核堿基功能化的石墨烯納米間隙電極，可以維持分子的最優(yōu)取向，從而顯著減少電流波動。鈍化電極邊緣可促進(jìn)偶聯(lián)[20-21]，減慢DNA通過納米間隙的速度，從而獲得更多測量單獨(dú)堿基的時間。Son等[22]發(fā)現(xiàn)，使用近紅外飛秒激光脈沖照射石墨烯納米間隙可產(chǎn)生亞循環(huán)電子脈沖(圖3)，有助于高損傷閾值和可調(diào)的設(shè)備研發(fā)。這種“識別隧穿”意在減緩DNA通過間隙的速度。因此，可以在電場驅(qū)動下通過納米間隙提取DNA序列信息。

目前利用石墨烯納米間隙電極來處理單個分子[23-24]已有報道，其中最大的挑戰(zhàn)是電極間的間隙要足夠小。Bellunato等[25]利用兩個扭曲的石墨烯納米電極，探究隧穿電流特性，分析隧穿電流與納米間隙電極的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)電壓和電流的關(guān)系曲線呈現(xiàn)s形，且這個形狀是電子穿過勢壘隧穿的一個顯著特征，勢壘高度由功函數(shù)決定，勢壘寬度由石墨烯邊緣之間的距離決定。除此之外，Bellunato等還探究了納米電極從隧穿系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)辄c接觸系統(tǒng)時的特點[25]：將納米電極緊密地連接在一起，電子傳遞就會從隧穿系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榻佑|系統(tǒng)，這種扭曲的結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致納米電極兩端交點處的單個碳原子之間產(chǎn)生初始接觸。在0.1 V偏置電壓下，當(dāng)隧道系統(tǒng)過渡到點接觸系統(tǒng)時，可以觀察到電流在約3 μA處扭結(jié)，并由此開啟點接觸系統(tǒng)。若電極進(jìn)一步接觸，則產(chǎn)生的電流會近似線性增加。若此時開始收縮納米電極恢復(fù)真空間隙狀態(tài)，則可觀察遲滯現(xiàn)象。

雖然石墨烯的狀態(tài)密度低，隧穿電流小，堿基波動(位置和取向)大，離子和水分子的布朗運(yùn)動會產(chǎn)生額外噪音，但是，已有的理論研究以及成功制備的納米間隙電極都為利用石墨烯納米間隙電極進(jìn)行DNA測序奠定了良好的基礎(chǔ)。

3 石墨烯納米帶測序法

石墨烯納米帶測序法依據(jù)DNA分子內(nèi)不同的堿基穿過石墨烯納米帶時的橫向電流不同達(dá)到DNA測序的目的。橫向電流通過納米帶的檢測原理是：在石墨烯納米帶上鉆出納米孔，核苷酸在外電壓的驅(qū)動下通過納米孔，引起納米孔周圍局部狀態(tài)密度的改變，從而可以檢測到石墨烯納米帶上橫向電流的改變[26]。這種方法的優(yōu)點是可以檢測到相對大的電流強(qiáng)度(μA)和高兆赫的平頻響應(yīng)，促進(jìn)高帶寬測量。Traversi等[27]利用納米帶上的電流和靜電電勢變化與DNA的有效橫截面積成正比來檢測DNA分子。Heerema等[28]使用定制的差分電流放大器區(qū)分電容電流信號和石墨烯電阻響應(yīng)，證明DNA通過納米帶時，在橫向電流中可以觀察到電阻變化。前期研究表明，磷酸骨架會產(chǎn)生系統(tǒng)噪聲，而分析多個納米帶之間的相互關(guān)系可能會減少并消除系統(tǒng)噪聲，以及DNA流經(jīng)納米帶而引起的熱液波動[29]。Mcfarland等[30]運(yùn)用密度函數(shù)理論和非平衡格林函數(shù)方法，確定了腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的透射譜和電流譜，以用于區(qū)分DNA/RNA測序的各種堿基。故不同的堿基與石墨烯納米帶的耦合強(qiáng)度不同，表現(xiàn)為不同堿基的橫向電流不同。

雖然石墨烯是無間隙半導(dǎo)體，但其性能會隨邊緣輪廓的變化而改變。理論模擬顯示，扶手椅型納米帶具有半導(dǎo)體性質(zhì)，而鋸齒狀的納米帶則具有金屬的性質(zhì)且邊緣電流曲線達(dá)到峰值，這種特性大大簡化了測序儀的制造。橫向電流比離子電流和隧穿電流大得多，但電阻卻比納米孔和納米間隙小得多[1]，因此，可以在更高的帶寬下進(jìn)行測量，這意味著人們能夠以更快的速度測量DNA序列，甚至可能是正常DNA分子通過納米帶的速度。Nelson等[31]分別在有無DNA鏈的情況下對狀態(tài)密度進(jìn)行積分，成功計算出扶手椅型納米帶的電流，結(jié)果表明該石墨烯納米帶測序裝置可以區(qū)分4個不同的堿基，并且發(fā)現(xiàn)橫向電流對鏈的取向不敏感。Paulechka等[26]利用石墨烯的電子特性，有效地結(jié)合沃森-克里克堿基互補(bǔ)配對功能化石墨烯納米帶(圖4)。當(dāng)DNA堿基與石墨烯納米帶官能團(tuán)互補(bǔ)時，原子分子動力學(xué)模擬預(yù)期會形成氫鍵。由于DNA-石墨烯納米帶局部結(jié)合，石墨烯納米帶將被拉上并向平面外偏轉(zhuǎn)，然后在達(dá)到氫鍵斷裂所需的臨界力時恢復(fù)。故可以根據(jù)石墨烯納米帶暫時性偏轉(zhuǎn)引起的電流變化來檢測堿基。

圖4 核酸堿基功能化石墨烯納米帶邊緣示意圖[26]Fig.4 Schematic of nucleobase-functionalized the graphene nanoribbons[26]

了解石墨烯納米帶在水溶液中的聚合行為對于預(yù)測石墨烯納米帶與DNA分子的相互作用至關(guān)重要。Wijeratne等[32]發(fā)現(xiàn)有些石墨烯納米帶的力曲線只有一個力峰，有些則有多個力降和力峰。力曲線上的這些特征可能是受石墨烯納米帶中褶皺、環(huán)狀、螺旋或其他變形的影響。石墨烯納米帶與蛋白質(zhì)、DNA等生物聚合物具有相似的力伸長行為，其硬度隨著化學(xué)功能的降低而增加。石墨烯納米帶由于和dsDNA具有生物相容性，可能形成與dsDNA(如雙螺旋)相似的構(gòu)象。鑒于dsDNA和蛋白質(zhì)的構(gòu)象不同，石墨烯納米帶在受到外界機(jī)械力作用時，可能包含不同的構(gòu)象變形。

4 結(jié)論與展望

本文綜述了石墨烯納米孔、納米間隙、納米帶在DNA測序領(lǐng)域中的最新研究進(jìn)展，為DNA測序研究提供了前沿的、有價值的參考。

盡管基于石墨烯納米技術(shù)的DNA測序技術(shù)已經(jīng)取得了令人矚目的成果，但仍面臨許多挑戰(zhàn)：(1)DNA通過石墨烯納米孔道的速度太快，導(dǎo)致無法從電流放大器中提取每個堿基的信息；(2)DNA分子和石墨烯具有親水作用，容易產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸附效果；(3)電流的信噪比低；(4)石墨烯的幾何形狀不穩(wěn)定，難以實現(xiàn)百分之百的復(fù)制重現(xiàn)。因此，DNA測序關(guān)鍵技術(shù)的突破將取決于上述難題的攻克。我們相信，在不久的將來，通過高速、可靠的DNA測序技術(shù)革命，借助DNA序列可視化等有力工具，將實現(xiàn)早期的疾病診斷和治療，以及了解相關(guān)遺傳疾病的機(jī)理，并且有望開發(fā)個性化基因組藥物和探索藥物輸送等。