基于氣相離子遷移譜研究肺隱球病患者呼出氣中特征揮發(fā)性有機(jī)物

王 彤，曾沛熒，王明蝶，李征途，李 雪，霍羽佳，張志娟,4*，葉 楓*

(1.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州呼吸健康研究院，呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 廣州 510120；3.山東海能科學(xué)儀器有限公司，山東 德州 251500；4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

肺隱球菌病(Pulmonary cryptcoccosis,PC)是由新型隱球菌引起的一種急性、亞急性或慢性深部真菌感染，已成為目前常見的感染性疾病[1]。近年來，肺隱球病的發(fā)病率逐年升高，其臨床診斷的難點(diǎn)在于臨床表現(xiàn)無特異性[2]，且處于不同免疫狀態(tài)下患者的表現(xiàn)也各不相同。目前，肺隱球菌病的診斷方法主要有影像學(xué)檢查、標(biāo)本培養(yǎng)檢查以及傳統(tǒng)織病理學(xué)檢查等，其中影像學(xué)檢查是診斷肺隱球病患者的重要方法，但受到宿主免疫狀態(tài)影響，如免疫功能正常的宿主影像表現(xiàn)和肺癌患者相似，易誤診成肺癌；標(biāo)本培養(yǎng)(如痰標(biāo)本、咽拭子等)檢查易出現(xiàn)假陽性，耽誤患者治療時(shí)間；傳統(tǒng)的組織(如肺泡灌洗液、肺部組織等)病理學(xué)檢查一直是肺隱球病檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其獲取肺泡灌洗液過程中會(huì)對患者造成身體上的創(chuàng)傷[3-4]。呼氣診斷具有快速簡單、非入侵性、無創(chuàng)無痛、樣本采集不受限制、樣本前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，在肺部真菌感染疾病領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸引起關(guān)注。如Chambers等[5]采用固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME/GC-MS)法靶向檢測煙曲霉患者呼氣和煙曲霉菌株中的VOCs，發(fā)現(xiàn)2-戊基呋喃同時(shí)存在于患者呼氣和菌株中，但后期研究發(fā)現(xiàn)辣椒中也能檢出2-戊基呋喃[6]；Koo等[7]同樣采用SPME/GC-MS方法檢測煙曲霉患者呼氣和煙曲霉菌株中的15種VOCs，發(fā)現(xiàn)α和β-反式佛手柑油烯、β-朱欒樣倍半萜烯、反式香葉基丙酮同時(shí)存在于人體呼氣和菌株中。由此可見，呼氣標(biāo)志物有可能受到飲食干擾，在呼氣采集時(shí)應(yīng)充分考慮相關(guān)影響因素；其次，采用多種VOCs組合的方式，可能會(huì)提高呼氣診斷的靈敏度和特異性。肺隱球菌同樣屬于肺部真菌感染類疾病，但目前尚未見肺隱球菌呼氣中VOCs成分的研究。因此，研發(fā)肺隱球菌病非侵害性診斷方法具有重要的臨床意義。

氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)可實(shí)時(shí)在線分析呼氣中醛、酮、醇等化學(xué)性質(zhì)活潑的有機(jī)化合物，減少離線采樣造成的呼氣樣本中化學(xué)性質(zhì)活潑成分的損失，且樣品分析時(shí)間短，單個(gè)樣品僅需10 min，操作簡單，適用于臨床診斷。GC-IMS[8]包括GC和IMS兩個(gè)部分，樣品中各化合物因物理化學(xué)性質(zhì)不同在GC色譜柱中流出時(shí)間不同，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)分離，預(yù)分離后的化合物在電離區(qū)被電離為離子，進(jìn)入離子遷移管中進(jìn)一步分離。如Allers等[9]采用GC-IMS檢測慢性肺阻塞患者的呼氣，篩查出3種VOCs在慢性肺阻塞患者與健康對照呼氣中存在顯著區(qū)別。Lewis等[10]發(fā)現(xiàn)GC-IMS有望用于細(xì)菌性呼吸道感染的早期診斷中，可避免病因不明確而造成抗生素濫用。由此可見，GC-IMS在人體呼吸道疾病的呼氣診斷中表現(xiàn)出色，具有良好的應(yīng)用前景?；诖?，本文采用GC-IMS分析肺隱球病患者呼氣中的VOCs，并通過與肺曲霉病患者和健康對照組呼氣中VOCs比較，研究肺隱球病患者呼氣VOCs與曲霉病患者及健康人群等對照組的差異性，篩選出肺隱球病患者呼氣中的特征VOCs。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BreathSpec GC-IMS氣相色譜離子遷移譜(德國G.A.S公司)；Milli-Q超純水系列(美國Millipore公司)；二壬酮、二辛酮、二庚酮、二己酮、二戊酮、二丁酮6種標(biāo)準(zhǔn)液體，使用6種標(biāo)液的頂空氣作為標(biāo)氣(J&K Chemicals)；氮?dú)?99.999%，廣州英萊氣體有限公司)。

1.2 受試者基本信息

受試者呼氣樣品采集于廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，采集時(shí)間為2018年4月3日至2018年6月4日，肺隱球病患者和肺曲霉病患者均為經(jīng)美國隱球菌診治指南[11]和美國感染協(xié)會(huì)(IDSA)制定的曲霉診治指南[12]臨床確診的患者；對照組為肺部未感染的健康受試者和確診的肺曲霉病患者。受試者共納入肺隱球菌患者20例、肺曲霉病患者28例、健康組33例，其基本信息見表1。分析呼氣樣品時(shí)，同時(shí)分析環(huán)境空氣樣品作為背景對照。

1.3 樣品采集

表1 受試者基本信息表Table 1 Basic information of the subjects

*Smoking:subjects with smoking habits during breath test;Quit:subjects who had quit smoking during breath test;Never:subjects who never smoke

呼氣樣本采樣前，受試者采用鼻吸口呼的方式深呼吸3次，再用鼻子深吸一口氣，屏息10 s后開始吹氣[13]，吹氣方式如圖1所示，受試者呼出氣中的前半段(約5 s)將管路中的廢氣吹出，后半段(約5 s)采集至1 mL的定量環(huán)中，隨后進(jìn)入檢測器。由于人體呼出氣中含有大量水蒸氣，溫度約為35～37 ℃，為防止人體呼氣中的水蒸氣冷凝，造成呼氣中VOCs組分損失[14]，呼氣將通過40 ℃恒溫的保溫管進(jìn)入GC-IMS。環(huán)境樣本采集方法：利用儀器內(nèi)部的采樣泵，和呼氣樣本采集方式保持一致，通過保溫進(jìn)樣管路直接抽取環(huán)境空氣樣本，進(jìn)樣速率10 mL/min。

圖1 人體呼氣采集-分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of human breath sampling and analysis using GC-IMS

1.4 呼氣采集的質(zhì)量控制

(1)每天早上07∶00開始采集受試者的呼吸氣，為了排除牙膏和口腔氣味的干擾，要求受試者無需刷牙，清水漱口后開始吹氣。(2)受試者吹氣前需靜坐0.5 h，避免因劇烈運(yùn)動(dòng)造成呼氣中異戊二烯濃度升高[15]。(3)由于飲食會(huì)造成呼氣中丙酮等VOCs含量變化[16]，因此呼氣采集前一天要求受試者在19∶00之后禁食且不得飲用清水之外的飲品。(4)由于吸煙會(huì)造成呼氣中乙腈含量明顯升高，飲酒會(huì)造成呼氣中乙醇含量短時(shí)間內(nèi)升高[17]，為避免這些干擾，采樣前一天受試者禁止吸煙飲酒。(5)為避免辣椒影響呼氣中2-戊基呋喃含量[6]，要求受試者在吹氣前24 h內(nèi)不要食用辣椒。(6)同時(shí)收集受試者年齡、性別、病史、近3天飲食狀況等信息。(7)所有受試者呼氣樣品均需采集3個(gè)平行樣以及一個(gè)環(huán)境樣比對。

1.5 分析條件

本研究采用商品化的BreathSpec GC-IMS在線分析系統(tǒng)進(jìn)行呼氣檢測[18]，MXT-200 GC色譜柱(3 000 mm×0.53 mm，膜厚：0.50 μm)，正離子模式檢測，離子遷移管管長98 mm，電壓6 500 V，離子源：氚源，電離方式：軟化學(xué)電離。漂移氣：氮?dú)?N2，純度≥99.999%)，漂移氣流速：150 mL/min。

GC-IMS校準(zhǔn)：使用二壬酮、二辛酮、二庚酮、二己酮、二戊酮、二丁酮的標(biāo)準(zhǔn)液體配成質(zhì)量濃度為50 μg/L的混標(biāo)溶液，取標(biāo)液的頂空氣進(jìn)樣，將結(jié)果的遷移時(shí)間和保留時(shí)間與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GC×IMS Library Search和LAV 2.0.0軟件(Laboratory Analytical Viewer,德國G.A.S公司，儀器自配)分析受試者呼氣VOCs。利用軟件內(nèi)置的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫，通過匹配離子遷移時(shí)間和保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。譜圖中的每個(gè)特征峰代表1種揮發(fā)性有機(jī)物，手動(dòng)框選出特征峰所在區(qū)域，以歸一化之后的該特征峰區(qū)域的相對強(qiáng)度作為參數(shù)變量進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

將已獲取的化合物信息根據(jù)肺隱球病、肺曲霉病和健康對照組進(jìn)行分類，再用SIMCA軟件(Version 14.1 MKS Umetrics)建立正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型，將獲取的高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理[19]，并計(jì)算OPLS-DA模型中檢查因子的VIP值，基于VIP≥1.0的標(biāo)準(zhǔn)[20]，篩選出一組肺隱球菌患者的特征性VOCs。

2 結(jié)果與討論

2.1 受試者呼出氣中VOCs的定性

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品分析校正，基于NIST和IMS數(shù)據(jù)庫，在肺隱球病患者、肺曲霉病患者和健康對照組呼氣中共檢出19種VOCs(表2)，包括6種酮類(丙酮、4-甲基-2-戊酮、2-丁酮、2-戊酮、2,3-戊二酮、3-戊酮)、2種醇類(辛醇、乙醇)、3種醛類(2-甲基-1-丙醛、丁醛、己醛)、2種酯類(乙酸乙酯、己酸乙酯)、3種烯烴(檸檬烯、β-蒎烯、苯乙烯)、2種芳香烴(吡啶、異丙苯)和1種含氮六元雜環(huán)化合物(1,8-桉樹腦)。除去檸檬烯外有18種化合物與之前的肺曲霉病呼氣研究的靶向物質(zhì)不重合，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步擴(kuò)充了肺曲霉病呼氣研究的揮發(fā)性有機(jī)化合物譜庫。

表2 受試者呼氣成分定性表Fig.2 Exhalation samples identified by GC-IMS

2.2 肺隱球菌病患者呼氣中的特征VOCs篩查

圖2 肺隱球病患者、肺曲霉病患者和健康組呼氣PCA分析圖Fig.2 PCA analysis of patients with pulmonary cryptococcosis pulmonary aspergillosis and healthy control

將肺隱球菌病患者與對照組(肺曲霉病患者、健康受試者)進(jìn)行PCA分析(圖2)。由圖可見，肺隱球菌病患者呼氣與健康對照組之間存在明顯的區(qū)別，但與肺曲霉病患者呼氣無顯著差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺曲霉病患者呼氣和健康受試者之間有明顯區(qū)別，這可能是由于肺隱球病和肺曲霉病同為真菌感染，因此呼氣代謝中存在相似的VOCs成分。

進(jìn)一步采用OPLS-DA模型分析(圖3A)，發(fā)現(xiàn)肺隱球病患者與健康對照組的呼氣能很好地區(qū)分，驗(yàn)證了PCA分析結(jié)果；再根據(jù)VIP≥1.0的標(biāo)準(zhǔn)篩選出的肺隱球菌病患者呼氣中的特征性VOCs包括2-甲基-1-丙醛、異丙苯、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、丁醛和己醛(圖3B)。

圖3 肺隱球菌病患者與健康對照組呼氣OPLS-DA分析圖(A)及肺隱球菌病患者呼氣成分VIP值示意圖(B)Fig.3 OPLS-DA analysis of exhalation in patients with pulmonary cryptococcosis and healthy control(A) and VIP value of pulmonary cryptococcosis(B)VOCs:1.2-methyl-1-propanal,2.isopropyl benzene,3.2-pentanone,4.4-methyl-2-pentanone,5.butanal,6. hexanal,7.octanol,8.2-methyl-1-propanal,9.2,3-pentanedione,10.3-pentanone

本研究進(jìn)一步應(yīng)用OPLS-DA模型分析了肺曲霉病患者與健康受試者的呼氣VOCs差異(圖4A)。由圖可見，肺曲霉病患者呼氣VOCs與健康對照組存在明顯差異，篩選出的肺曲霉菌感染患者呼氣中特征性VOCs包括2-丁酮、2-戊酮、異丙苯、2-甲基-1-丙醛、4-甲基-2-戊酮和3-戊酮(圖4B)。

圖4 肺曲霉病患者與健康對照組呼氣呼氣OPLS-DA分析圖(A)及肺曲霉病患者呼氣成分VIP值示意圖(B)Fig.4 OPLS-DA analysis of exhalation in patients with pulmonary aspergillosis and healthy control(A) and VIP value of pulmonary aspergillosis(B)VOCs:1.2-butanone,2.2-pentanone,3.isopropyl benzene,4.2-methyl-1-propanal,5.4-methyl-2-pentanone,6.3-pentanone,7.octanol,8.2,3-pentanedione,9.limonene

研究結(jié)果表明，肺部真菌感染(肺隱球病和肺曲霉病)患者的呼氣VOCs和健康對照組之間均存在顯著差異，但肺隱球病與肺曲霉病之間無顯著區(qū)分。這可能因?yàn)閮烧咄瑸檎婢腥?，在人體內(nèi)部氧化應(yīng)激的過程相似，所以在呼氣代謝中存在相似VOCs成分。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用OPLS-DA模型對肺隱球病患者、肺曲霉病患者及健康對照組呼氣VOCs進(jìn)行分析，篩選出相應(yīng)的特征性VOCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺隱球病和肺曲霉病的呼氣特征性VOCs均存在異丙苯、2-戊酮、2-甲基-1-丙醛和4-甲基-2-戊酮，其中2-戊酮和4-甲基-2-戊酮是較為常見的真菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[21-23]；肺隱球病患者呼氣中的特異性VOCs為丁醛和己醛。目前，肺隱球患者呼氣中VOCs來源的研究還十分有限，鑒于真菌感染肺部時(shí)，菌體和菌體代謝產(chǎn)物中的某些毒素會(huì)在肺部引起炎癥[24]，從而加劇人體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成過氧化損傷，而人體過氧化損傷過程會(huì)導(dǎo)致羰基化合物的形成(醛酮類物質(zhì))[25]，且在上呼吸道感染患者呼氣中也發(fā)現(xiàn)過醛酮類物質(zhì)[26]，因此可初步推測丁醛和己醛可能為隱球菌感染肺部后過氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物。

3 結(jié) 論

本研究采用氣相色譜離子遷移譜(GC-IMS)在線檢測人體呼氣，操作方便快捷，過程中無樣品損失，在81例人體呼氣中共檢出19種VOCs。應(yīng)用PCA分析獲取的化合物信息，發(fā)現(xiàn)同為肺部真菌感染的肺隱球病和肺曲霉病患者呼氣之間區(qū)分不顯著，但二者與健康人群呼氣有明顯區(qū)分。另外，通過OPLS-DA模型篩選出肺隱球病和肺曲霉病患者相對于健康人群的特征性VOCs，發(fā)現(xiàn)肺隱球病和肺隱球病篩選出的特征性VOCs均包括異丙苯、2-戊酮、2-甲基-1-丙醛和4-甲基-2-戊酮，而未重合的丁醛和己醛在肺隱球病患者呼氣的特異性更好。由此可見，使用GC-IMS可對人體呼氣進(jìn)行快速檢測，并識(shí)別出肺隱球病患者呼氣中的特征性VOCs，因此肺隱球菌病可以通過呼氣檢測的方法進(jìn)行診斷。但是，由于真菌有傳染性且滅活困難，進(jìn)行體外菌株及小鼠實(shí)驗(yàn)較為困難，因此目前通過呼氣檢測篩選出的特征性化合物的來源為初步推測，具體代謝過程仍需后續(xù)研究證實(shí)。