熱分離進樣/氣相色譜-質(zhì)譜法測定橄欖油中脂肪酸乙酯

侯 靖，劉夢婷，盧躍鵬，王 澍，周瑋婧

(武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430012)

橄欖油的真?zhèn)渭捌焚|(zhì)判別一直倍受關(guān)注，國際橄欖油協(xié)會標準COI/T.15/NC No 3/Rev.14及國際食品法典CODEX STAN 33-1981將橄欖油主要劃分為初榨橄欖油和精煉橄欖油，其中初榨橄欖油要求采用機械壓榨等物理方式直接從油橄欖果實中榨取油脂，并根據(jù)油脂的質(zhì)量分為多個等級;對質(zhì)量不符合要求的初榨橄欖油，可通過精煉的方式獲得精煉橄欖油。品質(zhì)不良及貯藏不當?shù)拈蠙旃麜l(fā)酵產(chǎn)生乙醇，從而與游離脂肪酸反應(yīng)生成脂肪酸乙酯。因橄欖油中含有較高的棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸，所以主要生成棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯等。已有研究經(jīng)感官評定發(fā)現(xiàn)有發(fā)酵缺陷的橄欖油中脂肪酸甲酯和乙酯的含量較高[1]，因此，國際橄欖油協(xié)會標準COI/T.15/NC No 3/Rev.14中規(guī)定特級初榨橄欖油中脂肪酸乙酯含量不得超過35 mg/kg，而歐盟標準(EU) No 1348/2013規(guī)定2015年后生產(chǎn)的特級初榨橄欖油中脂肪酸乙酯含量不得超過30 mg/kg。

目前，橄欖油中脂肪酸乙酯的檢測普遍采用國際橄欖油協(xié)會的COI/T.20/Doc.No 31方法，但該方法使用硅膠層析柱凈化，氣相色譜法測定，需手動填裝層析柱，操作繁瑣費時，不利于大批量檢測。已有文獻報道的氣相色譜法[2]及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]雖大大簡化了樣品前處理步驟，減少了溶劑的使用，但其采用的固相萃取及氮吹濃縮依舊耗時費力。其他報道如Boggia等[4]以熱解吸結(jié)合冷凍聚焦進樣，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測橄欖油中的脂肪酸烷基酯，方法無需前處理，但需加裝熱脫附和冷進樣系統(tǒng)，不利于普及;Berardinelli等[5]采用時域反射計在線采集橄欖油的時域反射信號，再經(jīng)過快速傅立葉轉(zhuǎn)換等數(shù)據(jù)處理，對橄欖油中的脂肪酸烷基酯含量進行測定，但其得到的為多種脂肪酸乙酯的總量，并不能分析出每個化合物的具體含量。

熱分離進樣是一種通過氣化溫度差異直接分析固體及液體試樣的技術(shù)，待測組分在進樣口發(fā)生氣化時，高沸點或不揮發(fā)的基質(zhì)保留在一次性微量進樣瓶中，從而實現(xiàn)待測物與基質(zhì)的分離[6]。使用該技術(shù)只需將熱分離進樣桿適配器安裝在進樣口即可，對于分流/不分流進樣口，需快速插入進樣桿以避免樣品過早氣化[7]，可使用具有程序升溫功能的進樣口以避免該情況的發(fā)生。熱分離進樣技術(shù)已被用于固體樣品中揮發(fā)性成分的檢測[8]，如與微吸附采樣技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于大氣污染物的快速檢測[9]，與吸附萃取攪拌棒聯(lián)合使用用于火場空氣中助燃劑的檢測[10]以及槍支射擊殘留物的檢測[11-12]。本研究首次采用熱分離進樣技術(shù)對橄欖油中的脂肪酸乙酯進行測定，可為橄欖油品質(zhì)快速鑒別提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-7010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，配多模式進樣口；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Vortex-Genie 2渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司)；熱分離進樣套件及玻璃微量樣品瓶購于美國Agilent公司。

正己烷(色譜純，德國Merck公司)；標準物質(zhì)：棕櫚酸乙酯(Palmitic acid ethyl ester)、硬脂酸乙酯(Stearic acid ethyl ester)、油酸乙酯(Oleic acid ethyl ester)、亞油酸乙酯(Linoleic acid ethyl ester)、十七烷酸甲酯(Heptadecanoic acid methyl ester，內(nèi)標)純度均大于99%，購于上海安譜實驗科技股份有限公司；特級初榨橄欖油質(zhì)控樣(材料代碼：PT-FC-790-X，英國LGC公司)。精煉橄欖油(作為空白基質(zhì))及特級初榨橄欖油，均購自武漢市場。

1.2 溶液配制

1.2.1 脂肪酸乙酯混合標準溶液的配制分別準確稱取棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯各100 mg(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的混合標準儲備液。臨用時取10 μL，用正己烷定容至1 mL，配成10 μg/mL的脂肪酸乙酯混合標準工作液。

1.2.2 十七烷酸甲酯內(nèi)標溶液的配制精密稱取十七烷酸甲酯100 mg(精確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，制成1 000 mg/L內(nèi)標儲備液。臨用時取內(nèi)標儲備液10 μL，用正己烷定容至1 mL，得10 mg/L的十七烷酸甲酯內(nèi)標溶液。

1.3 樣品制備

精確稱取0.1 g油脂樣品于10 mL容量瓶中，加入100 μL十七烷酸甲酯內(nèi)標溶液，用正己烷定容至刻度，渦旋振蕩使樣品充分溶解并混勻，再用移液槍吸取10 μL樣品溶液至玻璃微量樣品瓶中，室溫放置約2 h，使溶劑自然揮發(fā)。將揮干溶劑的樣品瓶放入熱分離進樣套件的樣品桿內(nèi)，并將進樣桿插入進樣口中，擰緊后開始進樣分析。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件采用DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱1)連接進樣口和反吹裝置；采用空毛細管色譜柱(1 m×0.15 mm，柱2)連接反吹裝置和質(zhì)譜儀；不分流進樣；進樣口初始溫度60 ℃，保持0.1 min，以600 ℃/min升溫至220 ℃，保持至分析結(jié)束；載氣為高純氦氣(純度>99.999%)。柱1為恒流模式，流速1.2 mL/min；柱2為恒壓模式，壓力為34.47 kPa；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，最后以 20 ℃/min升至280 ℃，數(shù)據(jù)采集結(jié)束后，再迅速升溫至300 ℃進行反吹；反吹壓力344.7 kPa，進樣口壓力關(guān)閉，反吹5 min；傳輸線溫度300 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件電離方式為電子轟擊源(EI)；電離能量70 eV；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲時間8 min；監(jiān)測方式為選擇離子監(jiān)測(SIM)，各化合物CAS號、保留時間、定量及定性離子信息見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 進樣溫度的選擇

熱分離進樣主要利用目標物和基質(zhì)的沸點差異進行分離，因此選擇合適的進樣口溫度是方法建立的關(guān)鍵。實驗先將載有微量樣品瓶的進樣口升溫至某一溫度進行數(shù)據(jù)采集，記錄4種脂肪酸乙酯的峰面積；不取出微量樣品瓶，繼續(xù)將進樣口溫度升至300 ℃再次采集數(shù)據(jù)記錄各化合物的峰面積，以第一次進樣峰面積與兩次進樣峰面積之和的百分比為該溫度下的進樣率。結(jié)果顯示，當進樣口溫度為200 ℃時，4種化合物進樣率均低于90%；當進樣口溫度為220 ℃時，4種化合物進樣率均在90%以上，且繼續(xù)提高進樣溫度，進樣率提升不明顯；考慮到進樣口溫度越高，基質(zhì)氣化進入色譜柱的可能性越大，因此在滿足目標化合物充分氣化的前提下，應(yīng)盡可能選擇較低的進樣口溫度。另外，實驗還比較了進樣口溫度為220 ℃時進樣前后微量樣品瓶中的油滴情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該溫度下進樣時樣品基質(zhì)基本無揮發(fā)。故本實驗選擇進樣溫度為220 ℃。

2.2 色譜條件優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，樣品檢測從連續(xù)進樣的第2個樣品開始，總離子流圖位的14.5 min處出現(xiàn)一較大的共流出化合物峰，影響目標物定量準確性，并污染儀器。通過對全掃描模式采集的數(shù)據(jù)及NIST譜庫檢索結(jié)果確認發(fā)現(xiàn)其為角鯊烯，這是因為角鯊烯在橄欖油中含量很高[13-14]，且為高沸點物質(zhì)，易在色譜柱中殘留。已有研究表明，柱后反吹技術(shù)可降低基質(zhì)影響，并有效地縮短分析時間[15]，因此實驗選擇在升溫程序結(jié)束后，繼續(xù)升高溫度并進行柱后反吹，即在分析結(jié)束后提高色譜柱后的氦氣壓力，并降低進樣口的氦氣壓力，使色譜柱中的氦氣反向流動，將殘留的高沸點物質(zhì)從分流出口吹出。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法顯著降低了角鯊烯的干擾，優(yōu)化條件下4種脂肪酸乙酯的加標總離子流圖見圖1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect)指的是樣品中除分析物以外的組分對分析結(jié)果的干擾，本研究以化合物的空白基質(zhì)標準曲線斜率與純物質(zhì)標準曲線斜率的比值來考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯及硬脂酸乙酯的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)分別為0.59、0.43、0.47和0.39，4種化合物均表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此采用空白基質(zhì)標準曲線進行定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

取空白基質(zhì)，向其中添加一定量脂肪酸乙酯混合標準溶液，分別配成4種脂肪酸乙酯質(zhì)量濃度為0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的基質(zhì)匹配標準溶液，在優(yōu)化條件下處理并測定。結(jié)果顯示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，4種脂肪酸乙酯與內(nèi)標的相對含量(x)與對應(yīng)的相對峰面積(y)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不低于0.999 6。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得4種脂肪酸乙酯的LOD均為0.3 mg/kg，LOQ均為1.0 mg/kg(表2)，可滿足橄欖油中脂肪酸乙酯的檢測需求。

表2 4種脂肪酸乙酯的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標準偏差(RSD)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,recoveries,relative standard deviations(RSDs),limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of 4 fatty acid ethyl esters

2.5 回收率與重復(fù)性

向空白基質(zhì)中添加1.0、2.0、10 mg/kg的4種脂肪酸乙酯進行加標回收實驗，每個添加水平平行6次，在優(yōu)化條件下處理后測定。結(jié)果顯示，4種脂肪酸乙酯在低、中、高3個加標濃度下的回收率為82.4%～109%，相對標準偏差(RSD)為0.68%～6.8%(表2)，表明方法的準確度和精密度良好，完全滿足實驗要求。

2.6 實際樣品及質(zhì)控樣品的檢測

在優(yōu)化條件下，對市售特級初榨橄欖油樣品(8批次)和質(zhì)控樣品分別采用本方法和SPE/GC-MS法[3]進行測定(表3)。結(jié)果顯示，本方法與SPE/GC-MS法測定結(jié)果無明顯差異，兩種方法測定同一樣品的相對標準偏差均在10%以內(nèi)；質(zhì)控樣中脂肪酸乙酯的指定值為32 mg/kg，滿意范圍為20.0～43.0 mg/kg，本方法與SPE/GC-MS方法的檢測結(jié)果相差不大，且均在質(zhì)控樣給定滿意范圍內(nèi)，表明本方法測定結(jié)果準確可靠。其中1號橄欖油樣品的總離子流圖見圖2。

表3 不同樣品中4種脂肪酸乙酯之和檢出情況Table 3 Detection of sum of 4 fatty acid ethyl esters in different samples (mg/kg)

圖2 1號橄欖油樣品中4種脂肪酸乙酯的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 4 fatty acid ethyl esters in sample No.1*.heptadecanoic acid methyl ester,1.palmitic acid ethyl ester, 2.linoleic acid ethyl ester,3.oleic acid ethyl ester, 4.stearic acid ethyl ester

3 總 結(jié)

本文采用熱分離進樣技術(shù)，通過優(yōu)化儀器進樣溫度，建立了一種無需前處理直接測定橄欖油中4種脂肪酸乙酯的方法。該方法簡便快捷，具有靈敏度高，準確度和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。通過對實際樣品及質(zhì)控樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)該方法與傳統(tǒng)的固相萃取(SPE)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)方法檢測結(jié)果相近，可替代傳統(tǒng)方法用于橄欖油中脂肪酸乙酯的快速檢測。