固相萃取/氣相色譜法測定禽蛋中19種農(nóng)藥殘留

李敏青，安文佳*，李 菊，王 嵐，莊 嘉，何曼莉

(1.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

2017年8月初，荷蘭爆出雞蛋受殺蟲劑大范圍污染的“毒雞蛋”事件，隨后幾乎蔓延至全世界，成為影響極大的食品衛(wèi)生丑聞，一時間使禽蛋的食品安全問題受到廣泛關(guān)注。蛋類和肉類、奶類一樣在中國的居民飲食結(jié)構(gòu)中占有非常重要的地位，但其檢測方法標準遠不及肉類和奶類全面。我國禽蛋產(chǎn)量自1985年躍居世界第一位以來，已連續(xù)30多年保持世界首位，鮮蛋主要出口香港、澳門和日本[1-2]。目前，我國標準《GB2763-2016食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》僅對蛋類中9種有機氯類農(nóng)藥作最大殘留限量(MRLs)要求[3]，中國香港特別行政區(qū)《食物內(nèi)殘余除害劑規(guī)例》規(guī)定禽蛋中MRLs的農(nóng)藥有109種[4]，國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、美國和日本等國家組織和地區(qū)亦均對蛋類中上百種農(nóng)藥作最大殘留限量規(guī)定，包括有機磷類農(nóng)藥與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，且最低限量要求為0.01 mg/kg[5-8]。這兩類殺蟲劑是我國廣泛使用的農(nóng)藥品種,主要用于蔬果和糧食作物的蟲害防治,但因其環(huán)境安全性問題,被列為重點檢測對象。

禽蛋這類動物源食品的基質(zhì)及其特有的乳化性，使得前處理中提取凈化過程復(fù)雜，難度大，目前為止，我國尚未有關(guān)于禽蛋的多種農(nóng)藥殘留檢測方法的標準，且對蛋類中非有機氯殺蟲劑殘留檢測的報道較少。調(diào)研現(xiàn)有文獻發(fā)現(xiàn)，禽蛋中農(nóng)藥殘留的檢測主要采用氣相色譜法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]，但其所用質(zhì)譜儀器較昂貴,檢測成本高?；诨鹧婀舛葯z測器(FPD)和電子捕獲檢測器(ECD)分別對有機磷類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測靈敏度很高，同時氣相色譜儀在基層實驗室較為普及，為填補相應(yīng)空白，滿足中國香港《食物內(nèi)殘余除害劑規(guī)例》，保證供港禽蛋品質(zhì)，本文建立了一種更為方便高效并能廣泛應(yīng)用于不同鮮禽蛋中的多種有機磷類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥同時測定的前處理方法,為保證禽蛋安全提供技術(shù)支撐,適用于大多數(shù)沒有色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的實驗室。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B型氣相色譜儀(配FPD)和7890A型氣相色譜儀(配ECD)均購于美國Agilent公司；XP205分析天平(感量0.01 g和0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；Sigma-3-18K高速低溫離心機(德國Sigma公司)；Turbo Vap LV氮吹儀(瑞典Biotage公司)；Heidolphpromax 2020水平往復(fù)振蕩儀(德國Heidolph公司)；IKA Ms 3 Basic渦旋振蕩器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

乙腈、乙酸乙酯(色譜純，美國Tedia公司)；QuEChERS提取鹽包(CEN EN-15662，內(nèi)含0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉，1 g檸檬酸鈉，1 g氯化鈉，4 g無水硫酸鎂，美國Shimadzu-GL公司)；氟甲腈(Fipronil-desulfinyl)、氟蟲腈硫醚(Fipronil sulfide)、氟蟲腈(Fipronil)、氟蟲腈砜(Fipronil sulfone)、聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、氯菊酯(Permethrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、敵敵畏(Dichlorvos)、甲胺磷(Methamidophos)、乙酰甲胺磷(Acephate)、二嗪磷(Diazinon)、樂果(Dimethoate)、甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、殺螟硫磷(Fenitrothion)、丙溴磷(Profenofos)19種農(nóng)藥標準物質(zhì)純度不低于98.5%，購自德國DR.E公司；石墨化炭黑(GCB)吸附劑(500 mg，3 mL，上海安譜公司)；C18固相萃取柱(500 mg，3 mL，Waters公司)；0.22 μm有機微孔濾膜(津騰公司)；實驗用水為經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液配制

標準儲備液：分別準確稱取適量19種農(nóng)藥標準品，用乙酸乙酯分別配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標儲備液，于0～4 ℃避光保存?；旌限r(nóng)藥標準儲備液：取適量19種農(nóng)藥的單標儲備液，以乙酸乙酯為溶劑，分別將有機磷類農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和氟蟲腈及其代謝物標準儲備液配成質(zhì)量濃度均為10 mg/L的混合標準儲備液，避光冷藏保存。實驗時根據(jù)需要，再用乙酸乙酯逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 加水處理將蛋品去殼，用攪拌機混合蛋液制成勻漿，稱取約10.0 g蛋液樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中，加入6 mL超純水，渦旋混勻30 s。

1.3.2 提 取向經(jīng)過加水處理的蛋液樣品中加入10 mL乙腈，水平振蕩提取10 min，再向提取液中加入QuEChERS提取鹽包，迅速搖勻且水平振蕩5 min，將離心管置于4 ℃冷凍離心機中以9 000 r/min離心5 min，準確吸取2.5 mL提取液于試管中，于40 ℃下氮吹至干后，用乙酸乙酯復(fù)溶至1 mL，待凈化。

1.3.3 凈 化稱取100 mg石墨化炭黑(GCB)吸附劑于C18固相萃取柱中，用4 mL乙酸乙酯(分2次，每次2 mL)活化SPE柱，棄去流出液。吸取上述待凈化提取液至SPE柱中，使樣液以1 mL/min的流速通過，用3 mL乙酸乙酯(分3次，各1 mL)洗脫并收集洗脫液，將洗脫液于40 ℃氮吹濃縮至小于1 mL，再用乙酸乙酯定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 ECD檢測器氣相色譜條件Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.25 μm)色譜柱；載氣：高純氮氣，3 mL/min；進樣體積：1 μL；不分流進樣；進樣口溫度：260 ℃；檢測器溫度：320 ℃；尾吹氣：高純氮氣，60 mL/min；柱溫箱升溫程序：初始溫度80 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至240 ℃后，以10 ℃/min升至260 ℃，保留30 min，總運行時間38 min。外標法定量。

1.4.2 FPD檢測器氣相色譜條件Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.25 μm)色譜柱；載氣：高氮氣，3 mL/min，進樣體積：1 μL，不分流進樣，進樣口溫度：270 ℃，檢測器溫度：245 ℃，氫氣：75 mL/min，空氣：100 mL/min，尾吹氣：高純氮氣，60 mL/min，柱溫箱升溫程序：初始溫度110 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至160 ℃后，保留2 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保留7 min，最后以25 ℃/min升至270 ℃，保留8 min，總運行時間35 min。外標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于鮮蛋中富含蛋白質(zhì)、脂肪以及維生素等營養(yǎng)成分，對農(nóng)藥測定干擾較大，鑒于各種分析物在不同溶劑中的溶解性，實驗考察了乙腈、乙酸乙酯、正己烷-丙酮(體積比1∶1)3種溶劑對鮮蛋中19種農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果顯示，3種溶劑對目標化合物的提取效率均達到70%以上，且以乙腈的提取效率普遍最高，正己烷-丙酮次之，乙酸乙酯最低。再比較經(jīng)3種溶劑提取濃縮后無法蒸干的油脂與雜質(zhì)發(fā)現(xiàn)，乙腈提取液中的共提取物較乙酸乙酯和正己烷-丙酮少。因此，實驗選擇乙腈為提取溶劑。另外，由于蛋液樣品具有一定黏性，單純使用乙腈提取可能存在分散不完全的現(xiàn)象，向其中加入少量水，可顯著提高乙腈對樣品的滲透性，將基體分散的更均勻，既可提高乙腈對目標物的提取效率，又減少了蛋液中主要干擾雜質(zhì)的溶入量，利于后續(xù)凈化。

2.2 除水劑的選擇

向經(jīng)加水處理后的蛋液樣品中加入10 mL乙腈，水平振蕩提取10 min后，分別考察加入2 g氯化鈉、3 g氯化鈉、1 g氯化鈉+4 g無水硫酸鎂或QuEChERS提取鹽包(1 g氯化鈉、4 g無水硫酸鎂、1 g檸檬酸鈉、0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉)4種不同除水劑對提取效率的影響。結(jié)果顯示，單獨加入NaCl的量多于2 g時，蛋液粘稠度增大，出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，而加入NaCl用量少于2 g時，水分不能完全去除。1 g氯化鈉+4 g無水硫酸鎂或QuEChERS提取鹽包的除水效果均較佳，但對于一些pH值較敏感的農(nóng)藥(如敵敵畏、甲胺磷、樂果和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥)，采用QuEChERS提取鹽包的回收率明顯較高，這是由于加入檸檬酸鈉和倍半水合檸檬酸二鈉形成一個穩(wěn)定的弱酸性緩沖體系，可使這類農(nóng)藥保持穩(wěn)定，從而提高了提取效率[18]。因此，本實驗選擇QuEChERS提取鹽包(1 g氯化鈉、4 g無水硫酸鎂、1 g檸檬酸鈉、0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉)進行除水。

2.3 離心方式的選擇

無水硫酸鎂除水時會放熱，使萃取液溫度升高更利于農(nóng)藥萃取，但同時可能增加了禽蛋中脂溶性雜質(zhì)在乙腈提取液中的溶入量。因此，實驗對比了禽蛋中經(jīng)乙腈及QuEChERS提取鹽包振蕩提取后，冷凍離心與常溫離心的提取液分層狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍離心后的乙腈層表面呈現(xiàn)一層薄薄的白色片狀脂肪層，而常溫離心后的乙腈層則完全溶解且均勻。因此，本實驗采用冷凍離心以便后續(xù)凈化操作。

2.4 凈化小柱的選擇

為更好地去除提取液中溶入的蛋液脂肪、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，實驗考察了以下4種不同SPE柱或混合柱方案的回收率：①100 mg GCB吸附劑+C18SPE柱(500 mg，3 mL)；②GCB/PSA混合柱(200 mg/200 mg，3 mL)；③500 mg Florisil吸附劑+GCB SPE柱(250 mg，3 mL)；④EMR-LipidSPE柱(300 mg，3 mL)。結(jié)果顯示，凈化方案①和④對19種化合物的回收率較好，分別為59.2%～113%和51.2%～130%，且兩者對樣品基質(zhì)的除雜凈化效果相當。但由于EMR-Lipid固相萃取柱的操作中要求待凈化液和洗脫液中含有20%水[19]，其后又須脫水處理，操作繁瑣費時。因此，在滿足檢測要求的前提下，綜合考慮檢測成本及提取效率，選取100 mg GCB吸附劑+C18SPE柱(500 mg，3 mL)凈化。

2.5 洗脫溶劑的選擇

以GCB吸附劑+C18SPE柱作為凈化柱，考察了乙腈、乙酸乙酯和正己烷-丙酮(體積比1∶2) 3種洗脫溶劑的洗脫效果。結(jié)果顯示，乙酸乙酯對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和個別有機磷農(nóng)藥的洗脫效果優(yōu)于乙腈，而采用正己烷-丙酮(體積比1∶2)溶劑洗脫時，引入了較明顯的雜質(zhì)峰，且雜質(zhì)與待測物不能完全分離，導(dǎo)致大多數(shù)農(nóng)藥回收不穩(wěn)定。因此，實驗選用乙酸乙酯進行洗脫。

2.6 儀器參數(shù)的優(yōu)化

擬除蟲菊酯類和有機磷類農(nóng)藥的常用測定方法有氣相色譜-電子捕獲檢測法/火焰光度檢測法、氣相色譜-質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中電子捕獲檢測器(ECD)和火焰光度檢測器(FPD)分別對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、氟蟲腈及其代謝物和有機磷類農(nóng)藥具有高選擇性和高靈敏度，與質(zhì)譜相比，成本低廉且操作簡便，因此本方法選擇GC/ECD和GC/FPD分別對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、氟蟲腈及其代謝物和有機磷類農(nóng)藥進行檢測。

另外，影響農(nóng)藥分離的主要因素包括色譜柱、載氣流速和程序升溫過程等，由于本研究所涉及目標化合物的極性范圍較廣，因而選擇中等極性色譜柱Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm,0.25 μm)進行分離富集。載氣流速和程序升溫條件參考文獻[20]優(yōu)化而得，詳見“1.4”，使沸點低、極性較小的成分先流出，同時可將色譜柱中殘留的組分完全揮發(fā)，避免樣品間殘留雜質(zhì)的干擾。在各自最優(yōu)氣相色譜條件下對6種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、氟蟲腈及其代謝物和9種有機磷類農(nóng)藥進行分離檢測，22 min內(nèi)即可實現(xiàn)全部分析物出峰，通過氣相色譜保留時間定性,19種農(nóng)藥在雞蛋中的加標色譜圖見圖1。

圖1 空白雞蛋樣品中添加6種擬除蟲菊酯農(nóng)藥(添加水平5 μg/kg)和氟蟲腈及其代謝物(添加水平2 μg/kg)的色譜圖(A)及添加9種有機磷農(nóng)藥的色譜圖(B)Fig.1 Gas chromatogram of 6 kinds of pyrethroid pesticides(5 μg/kg) and fipronil and its metabolites (2 μg/kg)(A) and 9 kinds of organophosphorus pesticides(10 μg/kg)(B) in egg 1.fipronil-desulfinyl,2.fipronil sulfide,3.fipronil,4.bifenthri,5.fenpropathrin,6.fipronilsulfone,7.permethrin, 8.cypermethrin,9.fenvalerate,10.deltamethrin,11.dichlorvos,12.methamidophos,13.acephate,14.diazinon, 15.dimethoate,16.pirimiphos-methyl,17.chlorpyrifos,18.fenitrothion,19.profenofos

2.7 方法學(xué)驗證

2.7.1 線性范圍、檢出限與定量下限取氟蟲腈及其代謝物質(zhì)量濃度為4、8、16、24、32 μg/L，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥為10、20、40、60、80 μg/L，有機磷農(nóng)藥為20、50、80、100、200 μg/L的混合標準工作液，在優(yōu)化條件下測定，以各待測物的峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標準曲線，并分別以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，19種農(nóng)藥在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.999 3，LOD為0.138～8.33 μg/kg,LOQ為0.461～27.8 μg/kg，結(jié)果見表1。實驗采用基質(zhì)匹配標準溶液考察了基質(zhì)效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和氟蟲腈及其代謝物在使用電子捕獲檢測器分離檢測時，以及有機磷類農(nóng)藥在添加水平為40 μg/kg時，采用基質(zhì)匹配標準溶液定量結(jié)果與采用標準溶液定量結(jié)果差別不大；有機磷添加水平在10～20 μg/kg時，少數(shù)化合物(敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、樂果)略有增強基質(zhì)效應(yīng)，但處在可接受范圍內(nèi)，因此實驗直接使用標準溶液定量，可滿足快速高通量的檢測需求。

2.7.2 回收率與相對標準偏差向空白雞蛋樣品中分別添加低、中、高3個濃度的19種農(nóng)藥混合標準液，每個濃度平行實驗6次，在優(yōu)化條件下測定，計算各化合物的回收率及相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示，氟蟲腈及其代謝物(氟甲腈、氟蟲腈硫醚及氟蟲腈砜)的平均回收率為78.6%～103%，擬除蟲菊酯類(聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯)農(nóng)藥的平均回收率為82.9%～103%，RSD為1.7%～7.9%，有機磷類(敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、二嗪磷、樂果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、殺螟硫磷及丙溴磷)農(nóng)藥的平均回收率為85.3%～105%，RSD為1.6%～5.5%(表1)，回收率和精密度均能滿足有機磷類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥同時分析的要求,所建方法重復(fù)性良好，符合《GB/T 27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范要求》[21]。

表1 19種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、平均回收率、相對標準偏差(RSD)、檢出限及定量下限Table 1 Linear ranges,calibration curves,linear correlations coefficients(r2),average recoveries,relative standard deviations(RSDs,n=6),limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 19 kinds of compounds

圖2 鴨蛋樣品中檢出氟蟲腈及其代謝物陽性色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of fipronil and its metabolites in duck’s egg1.fipronil desulfiny,2.fipronil sulfide,3.fipronil,4.fipronil sulfone

2.8 實際樣品檢測

采用本方法對市售40個鮮蛋樣品(雞蛋、鴨蛋、鴿蛋、鵪鶉蛋各10個)進行檢測。結(jié)果顯示，1批次雞蛋、2批次鴨蛋、1批次鵪鶉蛋中檢出氟蟲腈及其代謝物，檢出結(jié)果為氟蟲腈及其代謝物之和，以氟蟲腈表示，含量為12.5～24.7 μg/kg，其余鮮蛋均未檢出。其中一個鴨蛋陽性樣品的色譜圖見圖2。

3 結(jié) 論

本研究建立了QuEChERS提取鹽包和固相萃取柱凈化技術(shù)結(jié)合氣相色譜對鮮蛋中的9種有機磷、6種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和氟蟲腈及其代謝物同時分析的方法，方法操作簡單高效、可靠穩(wěn)定，能夠及時應(yīng)對大批量鮮蛋樣品中農(nóng)藥多殘留同時檢測的任務(wù)。