超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定血液中115種農(nóng)藥

杜秋瑤，張云峰，王繼芬，王 璐，常 靖，董林沛，吳小軍，劉冰潔

(1.中國人民公安大學 偵查與刑事科學技術(shù)學院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；4.愛博才思亞太應用支持中心，北京 100015)

在臨床和法醫(yī)毒理學領(lǐng)域，常需對血液、尿液、胃內(nèi)容物和內(nèi)臟器官等生物檢材中的毒物進行篩查和定量，以尋找疾病或死亡的原因[1-3]。常見的毒物主要包括農(nóng)藥、殺鼠劑、金屬毒物、揮發(fā)性毒物、臨床藥物、毒品、植物毒素、動物毒素、無機毒物9大類[4]。近年隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥的種類日益增多，使用范圍不斷擴大。常見的農(nóng)藥主要包括有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類、除草劑及其它水溶性農(nóng)藥[4]。農(nóng)藥的使用在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益的同時，也使各類有機污染物在環(huán)境和生物體內(nèi)積累，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。大量研究表明，農(nóng)藥暴露與某些慢性疾病的發(fā)生率升高之間存在聯(lián)系，包括癌癥、帕金森病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥、糖尿病、心血管疾病、慢性腎臟病及不育癥等[5]。慢性疾病的常見特征是細胞穩(wěn)態(tài)的紊亂，它往往可以通過農(nóng)藥對離子通道或酶受體等的擾動而誘發(fā)[5]。此外，由于意外、自殺或故意犯罪而導致的急性農(nóng)藥中毒案例也時見報道[6]。目前對農(nóng)藥殘留的高通量檢驗研究多集中在食品和環(huán)境樣本，研究者們建立了高通量檢測蔬菜、水果、茶葉、月柿、中藥材等樣本中農(nóng)藥殘留的方法[7-11]。本文致力于建立人體血液中農(nóng)藥的高通量檢驗方法，為臨床和法醫(yī)毒理學中農(nóng)藥的快速檢驗提供技術(shù)支持。

檢測血液樣本中農(nóng)藥的常用方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)，配置紫外(UV)或二極管陣列檢測器(DAD)的高效液相色譜法(HPLC)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[12-13]。其中串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因其高靈敏度、高專屬性和高通量的優(yōu)勢，得到了廣泛應用[14]。由于氣相色譜在親水性、熱不穩(wěn)定性和非揮發(fā)性農(nóng)藥中的適用性受限，更多檢測以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為主[15]。本研究結(jié)合實際中毒案例，選取了常見的115種農(nóng)藥，包括59種有機磷類農(nóng)藥、19種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、17種氨基甲酸酯類農(nóng)藥、17種除草劑，以及昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑噻嗪酮、人工合成的沙蠶毒素的類似物殺蟲單、低毒性殺菌劑三唑酮(詳見表1)。結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)進行分析研究，通過優(yōu)化分析條件和提取凈化方式，建立了同時測定血液中115種農(nóng)藥的方法。該方法簡單高效，實現(xiàn)了一針進樣同時對百種農(nóng)藥進行分析的目的，對臨床和法醫(yī)毒物檢驗工作具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

LC-30A HPLC儀器(日本Shimadzu公司)，配備兩個LC-30A泵，SIL-30A自動進樣器，CTO-30A恒溫柱室和DGU-30A脫氣機；具有Turbo VTM離子源的5500 QTRAP三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Sciex公司)；Milli-Q去離子水系統(tǒng)(法國Millipore公司)；DHC-16500臺式高速離心機(澳洲Kewlab公司)；Vortex-Genie2可調(diào)速渦旋混合器(美國SI公司)；移液器和2 mL離心管(德國Eppendorf公司)。

115種農(nóng)藥標準品(純度> 95%，德國Dr.Ehrenstorfer)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、甲酸銨(HPLC級，美國Fisher Scientific)；空白血由首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院提供。

1.2 標準溶液的制備

用甲醇將質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的混合標準品溶液稀釋至2.0 μg/mL，制得標準儲備溶液，將其在-20 ℃密封避光儲存。使用時用甲醇將標準儲備液稀釋成1.0 μg/mL的標準中間溶液，再逐級稀釋為200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/mL的標準工作液，4 ℃下密封避光保存。精確配制1.0 mol/L的甲酸銨標準儲備液，4 ℃下密封避光保存。

1.3 樣品的前處理

準確移取200 μL樣品于2 mL離心管中，加入1 000 μL甲醇作沉淀劑，渦旋振蕩2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液于配套液質(zhì)進樣瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜條件

Kinetex Biphenyl色譜柱(100 mm × 3.0 mm，2.6 μm)，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。流動相：A相為含5 mmol/L甲酸銨的水溶液；B相為含5 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；流速0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.1 min，3%～40% B；1.1～2.0 min，40%～60% B；2.0～7.0 min，60%～80% B；7.0～10.0 min，80%～83% B；10.0～10.1 min，83%～95% B；10.1～13.0 min，95%～98% B；13.0～15.5 min，98% B；15.5～15.6 min，98%～3% B；15.6～19.0 min，3% B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源和掃描方式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和電噴霧電離負離子模式(ESI-)同時切換掃描；檢測方式：Scheduled MRM；噴霧電壓IS：5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)；霧化氣(GS1)：379 225 Pa，離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：241 325 Pa；輔助氣(GS2)：341 750 Pa；碰撞氣(CAD)：48 265 Pa；化合物的射入電壓(EP)和碰撞室射出電壓(CXP)，在正離子模式時為10 V和17 V，負離子模式時為-10 V和-17 V。經(jīng)過優(yōu)化的所有分析物的其他參數(shù)，包括定量與定性離子對、去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)，見表1。儀器控制、數(shù)據(jù)采集和處理使用Analyst 1.6.3和SCIEX OS 1.5軟件進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

查閱文獻獲知化合物的分子式，在電噴霧離子源正負離子模式下，先用針泵進樣各目標化合物的單個標準溶液，使用Q1 Scan確定母離子的質(zhì)荷比；使用Product Ion Scan設定CE初始值為5 eV，以5 eV為步長自動調(diào)節(jié)CE，得到至少2～3個響應值高的特征子離子的質(zhì)荷比；根據(jù)選出的母、子離子，組建定量與定性MRM離子對，優(yōu)化CE和DP，以得到的參數(shù)初步建立MRM方法[16]。優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.2 流動相的優(yōu)化

圖1 115種農(nóng)藥的提取離子流色譜圖(10 ng/mL)Fig.1 Extracted ion chromatogram of 115 pesticides(10 ng/mL)

選用甲醇作為有機相B，比較了在有機相和水相中不加鹽與同時加入2、5、10 mmol/L甲酸銨時，各目標化合物的峰值響應情況，結(jié)果表明，當流動相中加入5 mmol/L甲酸銨時，所有目標農(nóng)藥在靈敏度、峰形和分離度等方面的綜合情況較好，故確定流動相中加入甲酸銨的濃度為5 mmol/L?？疾炝肆鲃酉嘣诓患铀?，以及加入體積比為0.01%、0.05%、0.1%甲酸的情況下，待測農(nóng)藥的峰值響應情況。結(jié)果表明，當流動相中不加酸時，各待測農(nóng)藥在靈敏度、峰形和分離度等方面的綜合情況較好，因而最終選用含5 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液-含5 mmol/L甲酸銨的水溶液體系作為流動相。以此流動相體系運行MRM方法，確定各待測農(nóng)藥的保留時間，建立Scheduled MRM方法，分時間窗口進行數(shù)據(jù)采集，以提高檢測效率和靈敏度[17]。115種農(nóng)藥的提取離子流圖如圖1所示。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

提取各類基質(zhì)中的農(nóng)藥常采用的前處理方法包括：沉淀蛋白法、液液萃取、固相萃取、分散固相微萃取、低共熔溶劑萃取以及QuEChERS前處理方法等[18-19]。本研究考慮到實際工作中快速高效的分析要求，考察了操作較為簡便的固相萃取和有機溶劑沉淀蛋白前處理方法。固相萃取采用HLB固相萃取小柱，分別考察了甲醇和乙酸乙酯作為洗脫劑時的提取效果。結(jié)果表明，HLB固相萃取法提取血液中的目標農(nóng)藥效果較差，部分農(nóng)藥不能有效提取。沉淀蛋白法考察了甲醇和乙腈兩種常用沉淀劑提取效果的差異，并研究了沉淀劑用量對回收率的影響[16]。在農(nóng)藥添加水平為10 ng/mL時，考察了樣品與沉淀劑的體積比分別為1∶2、1∶3、1∶5、1∶10時的加標回收率，以空白基質(zhì)匹配農(nóng)藥標準溶液做回收實驗。結(jié)果表明，當樣品與沉淀劑體積比為1∶2和1∶3時，乙腈的沉淀效果雖明顯優(yōu)于甲醇，但仍有部分目標農(nóng)藥的回收率未達到預期范圍。當樣品與沉淀劑的體積比為1∶5和1∶10時，兩種沉淀劑的提取效果和回收率無明顯差異，其中甲醇作為萃取溶劑，樣品與沉淀劑體積比為1∶5時，目標農(nóng)藥的加標回收率較好(80%～110%)，且由于甲醇毒性較乙腈低，因而最終確定以甲醇作為沉淀劑，樣品與沉淀劑體積比為1∶5的方法沉淀蛋白。

2.4 基質(zhì)效應

用空白基質(zhì)配制的標準溶液中目標農(nóng)藥的峰面積(A)與溶劑配制的標準溶液中目標農(nóng)藥峰面積(B)的比值來考察方法的基質(zhì)效應(ME)，ME=A/B×100%。當ME<100%時，說明基質(zhì)對目標物有抑制作用，當ME>100%時，則存在基質(zhì)增強效應[20]。分別計算農(nóng)藥添加質(zhì)量濃度為10、50、100 ng/mL時的基質(zhì)效應。根據(jù)實驗結(jié)果，所有目標農(nóng)藥的基質(zhì)效應為81.8%～115%。定量分析時應考慮基質(zhì)效應的影響，以確保方法的準確性和可靠性[21]。

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

在空白血液中分別添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合農(nóng)藥標準品，按照優(yōu)化的實驗條件進行測定，以目標物的質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果表明，115種農(nóng)藥在1～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.99)，87%目標農(nóng)藥的檢出限(LOD，S/N≥ 3)達到0.1 ng/mL，13%為0.2 ng/mL，115種農(nóng)藥的定量下限(LOQ，S/N≥ 10)均為1 ng/mL。說明該方法具有較高的靈敏度，可以滿足農(nóng)藥殘留測定的要求[22]。

2.6 回收率及日內(nèi)、日間相對標準偏差

分別在10、50、100 ng/mL 3個濃度水平下對空白血液樣品進行加標回收實驗，每個濃度水平在1天內(nèi)重復進樣6次，計算相對標準偏差(RSD)，得到日內(nèi)精密度(Intra-RSD)；連續(xù)進樣3天，計算日間精密度(Inter-RSD)。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，115種農(nóng)藥的回收率為80.4%～109%，日內(nèi)精密度為1.6%～11%(見表1)，日間精密度為1.9%～13%。說明該方法的重復性和準確性良好，證明了其在多農(nóng)藥分析中的可靠性和實用性。

表1 115種農(nóng)藥的保留時間(RT)、質(zhì)譜參數(shù)、回收率及相對標準偏差Table 1 Retention times(RT),MS parameters,recoveries and RSDs for 115 pesticides

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.7 實際案例應用

2019年9月,甘肅省某男子在家中用餐后中毒死亡，經(jīng)調(diào)查其妻子在該名男子所喝菜湯中加入了農(nóng)藥，農(nóng)藥來自于一標有“氯氰菊酯”字樣的塑料瓶，瓶內(nèi)農(nóng)藥已被倒光。送檢檢材包括塑料瓶的甲醇提取液約5 mL,死者血液樣品約3 mL。取10 μL塑料瓶提取液用甲醇逐級稀釋1 000倍進行分析，檢出高濃度的敵敵畏、毒死蜱和氯氰菊酯。取死者血液樣品200 μL按照本研究所建立的方法進行分析，檢出敵敵畏189.04 ng/mL，tR=4.93 min，定量離子對220.9/109.0(m/z)；毒死蜱171.32 ng/mL，tR=11.79 min，定量離子對349.9/197.9(m/z)；氯氰菊酯106.50 ng/mL，tR=12.73 min，定量離子對433.1/191.0(m/z)，其色譜圖見圖2。剩余檢材進行密封避光冷凍保存。實驗結(jié)果表明該方法可應用于實際案例的檢測。

圖2 3種農(nóng)藥的色譜圖Fig.2 Chromatograms of three pesticides

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定血液中115種農(nóng)藥的方法。該方法簡便快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好，滿足了實際工作中一針進樣同時對百種農(nóng)藥進行定性定量分析的需求，為法醫(yī)毒理學生物基質(zhì)中多農(nóng)藥的檢驗鑒定提供了高效可靠的途徑。