穿心蓮內(nèi)酯對大鼠腹腔粘連的抑制作用及其可能機制

瞿 慧 周繼法

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇省南京市 210029，電子郵箱：qurong2011@163.com)

術(shù)后腹腔粘連是臨床上常見且難以解決的問題。隨著腹部疾病發(fā)病率的升高和腹腔再手術(shù)患者的增多，術(shù)后腹腔粘連的發(fā)生率越來越高，輕度腹腔粘連發(fā)生率可高達80%[1-2]。腹腔粘連不僅會引起腹痛、腸梗阻等并發(fā)癥，還會增加出血的風(fēng)險[3-4]。目前，有多種物理方法可用于治療腹腔粘連，如各種生物相容性材料的使用可以減少粘連的發(fā)生，但這些材料的使用方法和技巧要求較高，而且這些物理方法也并不能完全解決粘連問題，且由于缺乏對早期粘連發(fā)生機制的了解，目前尚無理想的藥物治療腹腔粘連，因此腹腔粘連的治療仍是臨床難題之一。迫切需要探索有效的藥物治療方法。

通常，腹腔粘連由炎癥、腹膜損傷、組織缺血或外來物質(zhì)的存在引起，其主要病理特征為腹膜間皮細胞脫落、膠原纖維紊亂、纖維蛋白形成和降解不平衡、細胞外基質(zhì)沉積等[5-7]。研究表明，炎癥是腹腔粘連的重要誘發(fā)因素，一系列炎性因子可導(dǎo)致腹膜間皮細胞纖溶酶原活性降低[8]。此外，腹膜間皮細胞受損后會產(chǎn)生纖溶酶原激活物抑制物，從而抑制纖溶酶原及永久纖粘連蛋白的形成[9]。各種細胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、纖連蛋白、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)，都參與調(diào)控纖維蛋白沉積和降解之間的平衡。因此，目前針對腹腔粘連的研究主要集中于炎癥因子在病理過程中的作用，以及細胞因子在纖維蛋白沉積和降解中的作用[10-12]。大量體內(nèi)外實驗表明，從草本植物中提取的天然成分可有效地降低腹腔粘連程度[13]。在中醫(yī)方面，穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，Ad)主要用于減輕內(nèi)熱、解毒、緩解疼痛、減輕炎癥反應(yīng)。由于目前很多含有穿心蓮的復(fù)方主要用于治療術(shù)后炎癥，因此推斷其也可用于治療腸粘連[14]，但具體機制尚不清楚。本研究通過建立大鼠腹腔粘連模型，探討Ad預(yù)防腹腔粘連形成的效果及其可能機制。

1材料和方法

1.1 實驗動物 60只雄性SD大鼠，月齡10～11個月，體重240～260 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK-蘇 2014-0001。所有大鼠飼養(yǎng)在23℃～27℃，12 h光、12 h暗循環(huán)的環(huán)境中。所有的實驗操作都在實驗動物使用與管理委員會的規(guī)定下進行。

1.2 主要實驗藥品、試劑與儀器 所有化學(xué)試劑均為分析純。Ad(純度>98.0%)購自美國Sigma公司(批號：365645)；白細胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α 以及TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒均購自美國Abcam公司(批號分別為：ab100768、ab46070、ab119558)；CTGF 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自中國優(yōu)爾生科公司(批號：E90010Ra)，IL-18酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自美國GenwayBio公司(批號：GWB-ZZD136)。磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3)抗體(兔抗人多克隆IgG抗體)、Smad2/3抗體(兔抗人多克隆IgG抗體)、Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,Col-Ⅰ)蛋白兔抗人多克隆單抗IgG抗體、抗兔二抗均購自美國Abcam公司(批號分別為：ab63399、ab63672、ab34710、ab150077)，Smad7抗體(兔抗人多克隆單抗IgG抗體)購自英國PL實驗室(批號：PL0305198)；化學(xué)發(fā)光劑試劑盒購自加拿大Amersham Biosciences公司(批號：G524000)。XR1離心機、CE-400細胞培養(yǎng)箱和MultiskanTMGO微孔分光光度計均購自美國賽默菲舍爾公司，JXH生物安全柜購自中國蘇凈公司。

1.3 大鼠腹腔粘連模型的制備及給藥方法 所有大鼠在實驗前一晚禁食。按照體重將大鼠進行簡單隨機分組，包括正常對照組、模型組、地塞米松組以及Ad低、中、高劑量組，每組10只。手術(shù)操作在無菌環(huán)境中進行。麻醉采用氯胺酮(30 mg/kg)和甲苯噻嗪(15 mg/kg)腹腔注射。所有大鼠暴露腹部，剃毛，然后做一2 cm正中切口進腹；用干紗布磨損盲腸漿膜，形成2.5～3.0 cm的創(chuàng)面[15]，手術(shù)過程不超過20 min。所有動物在術(shù)后48 h按照以下方法給藥：正常對照組及模型組均腹腔注射生理鹽水4 mL/kg，地塞米松組腹腔注射地塞米松10 mg/kg，Ad低、中、高劑量組分別給予20、 40 、80 mg/kg Ad灌胃，1次/d，共給藥10 d。

1.4 粘連程度分級 給藥結(jié)束當(dāng)天，快速處死所有大鼠并切開腹部，按照Nair等[16]制定的方法對腹腔粘連的嚴重程度進行分級。腹腔粘連分為0～4級：0級為完全無粘連;1級為內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間存在1條粘連帶；2級為內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間存在2條粘連帶；3級為存在2條以上粘連帶，但內(nèi)臟未直接粘連到腹壁；4級為內(nèi)臟直接粘連到腹壁,不論粘連帶多少。在不了解大鼠的分組和處理方法的情況下，由其他人員對粘連的嚴重程度進行2次獨立的評估，2次評估結(jié)果不一致時進行第3次評估，最終根據(jù)3次評估結(jié)果綜合判定。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、 IL-18、TNF-α、TGF-β1和CTGF水平 給藥結(jié)束當(dāng)天，先腹腔注射生理鹽水2 mL，按摩大鼠腹部5 min后用針管吸取液體1 mL，并收集下腔靜脈血約0.5 mL，1 200 r/min離心20 min，提取血清并于-80℃保存。用酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒檢測血清IL-1β、 IL-18、TNF-α水平以及腹腔液中TGF-β1和CTGF水平。

1.6 大鼠腹膜間皮細胞的分離和提純 另取50只無腹腔疾病的SD雄性大鼠進行乙醚麻醉，然后腹腔注射0.25%胰蛋白酶1～2 mL。2 h后盡可能多地收集腹腔液，1 000 r/min離心30 min，收集大鼠腹膜間皮細胞(rat peritoneal mesothelial cell,RPMC)。通過檢測角蛋白和波形蛋白進行鑒定，純度達到90%以上。然后在含有10% 胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基中混懸細胞。

1.7 TGF-β1誘導(dǎo)RPMC纖維化 按5×105個/mL的濃度將RPMC接種于6孔板中，待細胞長至70%～80%時，改為無血清DMEM高糖培養(yǎng)24 h，然后將RPMC分為對照組、模型組、模型+不同濃度Ad組進行實驗：對照組繼續(xù)以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，模型組加入TGF-β1(終濃度為5 μg /L)培養(yǎng)24 h，模型+不同濃度Ad組加入TGF-β1(終濃度為5 μg /L)和Ad(終濃度為 10、20、40 μmol/L )培養(yǎng)24 h。

1.8 檢測RPMC中Col-Ⅰ蛋白、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白的表達 使用RIPA裂解液在冰上裂解各組細胞，細胞裂解后以1 000 r/min離心10 min。取上清液，用二喹啉甲酸法進行蛋白定量。用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗Col-Ⅰ(1 ∶1 000)、p-Smad2/3(1 ∶500)、Smad2/3(1 ∶500)、Smad7(1 ∶1 000) ，4℃過夜孵育，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶500)室溫下孵育2 h。以β肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行結(jié)果分析。其中，p-Smad2/3水平通過計算磷酸化蛋白吸光度/非磷酸蛋白吸光度的比值來定量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)表示，等級資料比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用拓展t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠腹腔粘連程度比較 6組大鼠腹腔粘連程度分級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=28.511，P<0.001)。其中其他組粘連程度均重于正常對照組，地塞米松組與Ad中、高劑量組的粘連程度均輕于模型組，所有劑量Ad組的粘連程度均重于地塞米松組(均P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠腹腔粘連程度

2.2 6組大鼠血清IL-1β、IL-18和TNF-α水平比較 (1)正常對照組的血清IL-1β水平均低于其他組(均P<0.05)，模型組、Ad低劑量組、Ad中劑量組、Ad高劑量組、地塞米松組的血清IL-1β水平依次降低(均P<0.05)。(2)正常對照組的血清TNF-α及IL-18水平均低于其他組；模型組的血清TNF-α及IL-18水平均高于地塞米松組(均P<0.05)，但模型組的IL-18水平與各劑量Ad組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；Ad低劑量組的血清TNF-α水平以及Ad各劑量組的IL-18水平均高于地塞米松組(均P<0.05)，Ad中劑量組、Ad高劑量組的TNF-α水平均低于Ad低劑量組(均P<0.05)，但Ad各劑量組間的IL-18水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血清IL-1β、TNF-α和 IL-18水平比較(x±s，ng/L)

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與地塞米松組相比，ΔP<0.05；與Ad低劑量組相比，▲P<0.05；與Ad中劑量組相比，■P<0.05。

2.3 6組大鼠腹腔液中TGF-β1和CTGF水平比較 (1)與正常對照組相比，模型組、Ad低劑量組、Ad中劑量組的腹腔液TGF-β1水平均升高(均P<0.05)；各Ad劑量組、地塞米松組的腹腔液TGF-β1水平均低于模型組(均P<0.05)；地塞米松組、Ad低劑量組、Ad中劑量組、Ad高劑量組的腹腔液TGF-β1水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。(2)正常對照組的腹腔液CTGF水平均低于其他組(均P<0.05)；與模型組相比，地塞米松組及Ad中、高劑量組的腹腔液CTGF水平均降低(均P<0.05)；Ad低劑量組、Ad中劑量組、Ad高劑量組的CTGF水平依次降低，且Ad組低劑量組、Ad中劑量組均高于地塞米松組(均P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠腹膜液 TGF-β1和CTGF表達水平比較(x±s，ng/L)

注：與正常對照組相比，*P<0.05;與模型組相比，#P<0.05;與地塞米松組相比，△P<0.05；與 Ad低劑量組相比，▲P<0.05；與Ad中劑量組相比，■P<0.05。

2.4 5組大鼠RPMC中的Col-Ⅰ蛋白表達水平、Smad7和Smad2/3磷酸化水平比較 (1)與對照組相比，其他組的Col-Ⅰ蛋白相對表達水平均增加(均P<0.05)。模型組、模型+10 μmol/L Ad組、模型+40 μmol/L Ad組、模型+20 μmol/L Ad組的Col-Ⅰ蛋白相對表達水平依次降低(均P<0.05)。(2) 與對照組相比，其他組的p-Smad2/3與Smad2/3比值均增加(均P<0.05)；與模型組比較，模型+10 μmol/L Ad組p-Smad2/3與Smad2/3比值升高、模型+20 μmol/L Ad組p-Smad2/3與Smad2/3比值降低(P<0.05)；模型+10 μmol/L Ad組、模型+40 μmol/L Ad組、模型+20 μmol/L Ad組的p-Smad2/3與Smad2/3比值依次降低(均P<0.05)。(3) 與對照組相比，模型+不同濃度Ad組的Smad7相對表達水平均升高(均P<0.05)；模型組、模型+10 μmol/L Ad組、模型+20 μmol/L Ad組、模型+40 μmol/L Ad組的Smad7相對表達水平依次升高(均P<0.05) 。見表4和圖1。

表4 5組細胞的Col-Ⅰ蛋白表達水平、Smad7和p-Smad2/3與Smad2/3比值比較(x±s)

注：與正常對照組相比，*P<0.01;與模型組相比，#P<0.05；與模型+10 μmol/L Ad組相比，▲P<0.05；與模型+20 μmol/L Ad組相比，■P<0.05。

圖1 5組細胞Col-Ⅰ、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7的表達情況

注：1、2、3、4、5分別代表正常對照組、模型組、模型+10 μmol/L Ad組、模型+20 μmol/L Ad組、模型+40 μmol/L Ad組。

3 討 論

本研究中，術(shù)后12 d，模型組的大鼠出現(xiàn)不同程度的腹腔粘連，大部分為3～4級，表明造模成功。一系列細胞因子，如IL-1β、IL-18和TNF-α等參與了炎癥過程，他們的表達水平與腹腔粘連程度顯著相關(guān)[17-18]，在腹腔粘連的形成中起著重要作用[19-22]。本研究中，術(shù)后12 d，模型組血清IL-1β、IL-18與TNF-α水平均高于對照組(均P<0.05)，這表明腹膜損傷可觸發(fā)炎癥反應(yīng)[23]。此外，用藥結(jié)束后Ad中、高劑量組的粘連程度均輕于模型組(P<0.05)，提示中高劑量的Ad有減輕腹腔粘連形成的作用；各劑量Ad組血清IL-1β和TNF-α水平均較模型組降低，且Ad中劑量組、Ad高劑量組血清TNF-α水平均低于Ad低劑量組，Ad低劑量組、Ad中劑量組、Ad高劑量組血清IL-1β水平依次降低(均P<0.05)，這表明Ad可抑制炎癥因子的表達，從而發(fā)揮抗腹腔粘連的作用，且高劑量Ad的抗炎作用更強。IL-18是一種重要的炎癥細胞因子，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起重要作用[24]。然而，本研究中，Ad各劑量組間IL-18水平差異無統(tǒng)計學(xué)(均P>0.05)，提示Ad并沒有影響IL-18水平。

CTGF是TGF-β1的下游因子，能促進纖維蛋白細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和抑制細胞外基質(zhì)降解[25-26]，使細胞外基質(zhì)積聚，最終導(dǎo)致腹膜纖維化和腹腔粘連。本研究結(jié)果顯示，模型組腹腔液TGF-β1和CTGF水平均高于正常對照組(均P<0.05)；而Ad各劑量組的TGF-β1水平、Ad中劑量組和高劑量組的CTGF水平均低于模型組，且Ad低劑量組、Ad中劑量組、Ad高劑量組的CTGF水平依次降低(均P<0.05)，這提示Ad可抑制腹腔粘連大鼠腹腔液中TGF-β1的表達，并可劑量依賴性地降低CTGF含量。

為了探討抗纖維化的潛在機制，我們用雄性大鼠(與雌性大鼠相比更少產(chǎn)生腹腔疾病)為實驗對象， 提取其RPMC，建立TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化細胞模型，并檢測細胞中相關(guān)蛋白的表達情況。Col-Ⅰ作為細胞外基質(zhì)的重要組成成分，其蛋白表達量是評估腹腔粘連發(fā)生的直觀指標和依據(jù)[27]。本研究中，模型+不同濃度Ad組的Col-Ⅰ蛋白表達水平均低于模型組，且模型+10 μmol/L Ad組、模型+40 μmol/L Ad組、模型+20 μmol/L Ad組的蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)，提示Ad可有效地降低腹腔粘連大鼠Col-Ⅰ蛋白的表達，其中20 μmol/L Ad的效果最好。TGF-β1在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。首先，它能誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化。此外，Smad信號通路激活后可直接導(dǎo)致細胞外基質(zhì)成分的合成，并促進纖維化的發(fā)生。一旦Smad2/3通路被激活，會導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生和發(fā)展。然而，Smad7是一種抑制性Smad因子，可以負性調(diào)節(jié)Smad2/3通路激活的負反饋機制[28-31]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，模型+20 μmol/L Ad組的p-Smad2/3與Smad2/3比值降低，模型+20 μmol/L Ad組、模型+40 μmol/L Ad組的Smad7相對表達水平均升高(均P<0.05)，即Ad可提高Smad7的表達并抑制Smad2/3的磷酸化。這提示Ad或可通過調(diào)節(jié)RPMC中的Smad信號通路來抑制粘連形成。

雖然在本研究中Ad各劑量組大鼠腹腔粘連程度均較地塞米松組嚴重(均P<0.05)，提示Ad對大鼠腹腔粘連的抑制作用稍差于地塞米松組，但是Ad并不影響傷口愈合且產(chǎn)生的副作用很少。同時，與預(yù)防性物理分離療法相比，Ad有易于給藥和安全性能強的特點。因此，Ad作為抗術(shù)后腸粘連的輔助藥物，具有較好的應(yīng)用前景。

總之，Ad對大鼠腹腔粘連的形成具有較好的抑制作用，其或可通過抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路來發(fā)揮作用。但是，Ad作為一種潛在的新型抗粘連治療藥物，其具體的作用機制、最佳劑量及不良反應(yīng)還需進一步研究探討。