液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定固體及液體藥物中27種新型毒品芬太尼類物質(zhì)

羅 耀，張建瑩，黃昌雄，卞學(xué)海，李 穎，梁淑雯

(深圳海關(guān) 食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

芬太尼(Fentanyl)是從阿片(罌粟)中提取的生物堿及衍生物，是一種強(qiáng)效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，其麻醉效力比海洛因強(qiáng)50倍，比嗎啡強(qiáng)100倍。但其也是一種成癮性毒品，2 mg的藥量足以致命。而且這類化學(xué)非法合成毒品易出現(xiàn)各種變體，例如芬太尼目前已知的變體有130多種。芬太尼類物質(zhì)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與芬太尼相比，符合以下1個(gè)或多個(gè)條件的物質(zhì)：①使用其他?；娲；虎谑褂萌魏稳〈蛭慈〈膯苇h(huán)芳香基團(tuán)替代與氮原子直接相連的苯基；③哌啶環(huán)上存在烷基、烯基、烷氧基、酯基、醚基、羥基、鹵素、鹵代烷基、氨基及硝基等取代基；④使用其他任意基團(tuán)(氫原子除外)替代苯乙基。圖1為5種典型芬太尼類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。芬太尼類物質(zhì)(Fentanyl analogs and metabolites)是新精神活性物質(zhì)(New psychoactive substances，NPS)的重要組成部分。新精神活性物質(zhì)又稱“策劃藥”或“實(shí)驗(yàn)室毒品”，是繼傳統(tǒng)毒品、合成毒品后全球流行的第3代毒品。

圖1 5種典型芬太尼類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of typical fentanyl analogs and metabolites

據(jù)報(bào)道，自2013年以來，海洛因和假藥配方中分別發(fā)現(xiàn)了非法芬太尼及其類似物，隨后緝獲的藥物材料和毒理學(xué)案例中發(fā)現(xiàn)的此類物質(zhì)數(shù)量急劇增加，2016年芬太尼及其類似物的致死人數(shù)超過海洛因[1]。由于該類物質(zhì)的毒性強(qiáng)、品種多、變異快、緝查難，已成為當(dāng)前國(guó)際禁毒領(lǐng)域面臨的一大難題。我國(guó)禁毒主管部門對(duì)芬太尼類物質(zhì)采取非常嚴(yán)格的監(jiān)管措施，列管品種達(dá)25種，超過了聯(lián)合國(guó)規(guī)定管制的21種。2019年4月我國(guó)首次將芬太尼整類物質(zhì)列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》，按類納入毒品管制范疇。為滿足新形勢(shì)下芬太尼類物質(zhì)的列管要求，助力海關(guān)打擊毒品犯罪，急需建立芬太尼類物質(zhì)的定性定量方法。

目前，芬太尼類物質(zhì)的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[1]、高效液相色譜法(HPLC)及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[2-15]，主要針對(duì)芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等單一物質(zhì)進(jìn)行分析，涉及血液、乳汁、尿液、唾液等生物基質(zhì)。聯(lián)合國(guó)毒品與犯罪問題辦公室推薦的方法中，GC-MS法僅涉及3種芬太尼類物質(zhì)[1]，液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)亦只涉及10多種芬太尼類物質(zhì)的篩查檢測(cè)[1]。針對(duì)廣泛的非法和處方芬太尼類物質(zhì)的LC-MS/MS檢測(cè)方法報(bào)道較少，導(dǎo)致處方芬太尼類藥物的過量流行和非法芬太尼類藥物的出現(xiàn)。本研究通過75%乙腈水結(jié)合乙腈提取固、液體藥物中的芬太尼類物質(zhì)，兩類藥物分別采用HLB固相萃取小柱及QuEChERS法凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，建立了固體和液體藥物中27種新型毒品芬太尼類物質(zhì)(包括芬太尼及26種類似物或代謝物)的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Endura LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配Ultimate 3000超高效液相色譜儀，Thermofisher公司)，Rax top渦旋振蕩儀(德國(guó)Heidolph公司)；3K18高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；高純水發(fā)生器(Milli-Q Integral 10+，美國(guó)Millipore公司)；0.22 μm 親水PTFE有機(jī)濾膜(上海安譜公司)。 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨(色譜純，德國(guó)Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國(guó)Waters公司)；N-丙基乙二胺吸附劑(PSA，美國(guó)Supelco公司)。27種芬太尼類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(化合物名稱見表1，質(zhì)量濃度100 mg/L，美國(guó)Cerilliant公司)，使用乙腈稀釋為1.00 mg/L和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-18 ℃避光存放。

1.2 樣品處理

1.2.1 固體藥物粉末稱取固體試樣0.100 g，加入2 mL 75%乙腈水，渦旋溶解，再加入2 mL 乙腈，渦旋30 s，超聲提取15 min。9 500 r/min 離心5 min后，吸取全部上清液于HLB固相萃取柱(預(yù)先用5 mL乙腈活化)中，待上清液全部流出，再加入4 mL乙腈淋洗。收集所有流出液，40 ℃水浴氮吹至低于0.5 mL，加入0.5 mL水，再以乙腈定容至1.00 mL，渦旋振蕩30 s，9 500 r/min 離心5 min。取上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜后，上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 液體藥物稱取液體試樣0.100 mL，加入2 mL 75%乙腈水，渦旋溶解，再加入2 mL 乙腈，渦旋30 s，超聲提取15 min。加入25 mg PSA，渦旋1 min，9 500 r/min 離心5 min。吸取所有上清液，40 ℃水浴氮吹至低于0.5 mL，加入0.5 mL水，再用乙腈定容至1.00 mL，渦旋振蕩30 s，9 500 r/min 離心5 min。取上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜后，上機(jī)測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus Phenyl-Hexyl(150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國(guó)Agilent公司)。流動(dòng)相：A為0.005 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；B為甲醇(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0～1.0 min，5% B；1.0～40 min，5%～55% B；40～45 min，55% B；45～45.5 min，55%～5% B；45.5～50 min，5% B。流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量：2 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，溫度：150 ℃；正離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管溫度：350 ℃；霧化器溫度：350 ℃；鞘氣壓力：35 Arb(Arbitrary units)；輔助氣壓力：8 Arb；分辨率：?jiǎn)挝环直媛?；駐留時(shí)間：30 ms。其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 27種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the detection of 27 compounds

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

由于芬太尼類物質(zhì)含有苯基、烷基和酰胺等基團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)差異較大，且同時(shí)存在部分同分異構(gòu)體，因此本方法采用苯基-己基色譜柱Eclipse Plus Phenyl-Hexyl(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，當(dāng)使用含甲醇的流動(dòng)相時(shí)，對(duì)極性胺類化合物和芳香族化合物有顯著的選擇性。結(jié)果表明，27種芬太尼類物質(zhì)均得到較好的分離和保留，其中包括2對(duì)同分異構(gòu)體(4-氟異丁酰芬太尼和4-氟丁酰芬太尼，丁酰芬太尼和對(duì)氟芬太尼)。

圖2 止咳水基質(zhì)加標(biāo)樣品(10.0 μg/L)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the spiked(10.0 μg/L) cough syrup samples the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇(含0.05%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(pH 3.0)、甲醇(含0.1%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)、乙腈(含0.1%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)、甲醇(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水、乙腈(含0.1%甲酸)-0.05%甲酸水5種流動(dòng)相的色譜分離效果。結(jié)果顯示，相較于在流動(dòng)相中加入0.05%甲酸，加入0.1%甲酸有利于提高分析物的離子化效率并改善色譜峰形，而加入乙酸銨可起到緩沖鹽的作用。由于乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，不利于4種同分異構(gòu)體的分離，最終實(shí)驗(yàn)確定以甲醇(含0.1%甲酸)-0.005 mol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相，并優(yōu)化了最佳洗脫程序。在“1.3”條件下，27種目標(biāo)化合物均可得到較好的分離度和峰形。止咳水基質(zhì)加標(biāo)樣品(質(zhì)量濃度為10.0 μg/L)中27種目標(biāo)化合物的MRM色譜圖見圖2。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇根據(jù)溶劑性質(zhì)、芬太尼類物質(zhì)性質(zhì)、樣品基質(zhì)特點(diǎn)和檢測(cè)靈敏度的要求及濃縮需要，本方法選擇乙腈水溶液作為提取溶劑。分別考察了50%乙腈水、75%乙腈水、100%乙腈作為提取溶劑時(shí)，固體、液體藥物樣品中27種目標(biāo)化合物的回收率。結(jié)果表明，乙腈中加適量水可增加固體藥物的溶解度，提高目標(biāo)化合物的提取效率；但加入過多水分不利于樣液的濃縮。綜合考慮，選取2 mL 75%乙腈水+2 mL 乙腈為提取溶劑。

2.3.2 HLB凈化柱洗脫液用量的選擇HLB固相萃取柱填料是親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮單體按一定比例組成的大孔共聚物。芬太尼類物質(zhì)大多為弱極性，而固體類試樣干擾物一般為淀粉、糊精、纖維素、色素以及固體賦型顆粒。本實(shí)驗(yàn)采用HLB固相萃取柱作為正相柱，吸附弱極性至中等極性的酸性、中性、堿性化合物以凈化固體樣品。

分別比較了洗脫液乙腈的不同用量(1、2、3、4、5 mL)對(duì)27種目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，乙腈洗脫量為4 mL時(shí)，27種目標(biāo)化合物的總體回收率較好(為73.3%～83.3%)，因此選擇洗脫液乙腈的用量為4 mL。

圖3 PSA用量對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響Fig.3 Effect of PSA dosage on recoveries of analytes

2.3.3 PSA吸附劑用量的選擇PSA是在高純硅膠基質(zhì)上鍵合N-丙基乙二胺的極性吸附劑，無端基封尾，主要保留機(jī)理為弱陰離子交換(水溶性基質(zhì))、極性吸附(非極性有機(jī)基質(zhì))、螯合作用，能有效去除基質(zhì)中的許多極性物質(zhì)(如色素、有機(jī)酸、糖等)。液體類試樣主要為有機(jī)酸、糖分、色素、維生素等，因此液體藥物采用PSA凈化。

分別比較了不同PSA用量(20、25、30、35、40 mg)對(duì)27種目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，在上述PSA用量下，除了N-苯乙基-4-哌替啶酮、4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)等的回收率略有偏差外，絕大部分化合物的回收率均大于70%(見圖3)。綜合考慮，選取PSA添加量為25 mg。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指不同的樣品基質(zhì)在質(zhì)譜檢測(cè)(特別是使用電離源)時(shí)由于離子化效應(yīng)而產(chǎn)生的離子增強(qiáng)或抑制作用。其計(jì)算公式為ME=Ka/Kb，其中Ka為樣品基質(zhì)的校準(zhǔn)曲線斜率，Kb為溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME接近100%時(shí)，表明無明顯的基質(zhì)效應(yīng)；大于100%時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；小于100%，則說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)考察了頭痛粉、止咳水樣品的基質(zhì)效應(yīng)，分別采用純?nèi)軇┖突|(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，按照本方法進(jìn)行測(cè)定得到目標(biāo)物的溶劑和樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，頭痛粉和止咳水樣品的ME值為105%～130%，存在較低的基質(zhì)效應(yīng)。因此，本方法采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性方程與定量下限在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，以50%乙腈水溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，并以峰面積對(duì)各組分的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。結(jié)果表明，27種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)與其定量離子的響應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99(見表2)。

基于回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)滿足歐盟SANTE/11813/2017要求的最低加標(biāo)水平[16]，以及加標(biāo)樣品的定量離子對(duì)色譜峰信號(hào)10倍信噪比(S/N)的要求，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外的殘留限量要求，確定27種目標(biāo)化合物在固體藥物中的定量下限均為10.0 μg/kg，液體藥物中均為10.0 μg/L。

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度采用空白的頭痛粉和止咳水作為驗(yàn)證基體，加標(biāo)水平為10.0、20.0、50.0 μg/kg(μg/L)，每個(gè)水平做6個(gè)平行。按本方法進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量，計(jì)算每種化合物的平均回收率及RSD。結(jié)果表明，27種芬太尼類物質(zhì)在頭痛粉中3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為84.8% ～106%，RSD為1.1% ～7.8%；在止咳水中的平均回收率為86.9% ～109%，RSD為0.86% ～8.5%(見表2)。

表2 27種芬太尼類物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Regression equations,correlation coefficients(r2),recoveries and relative standard deviations of 27 compounds(n=6)

Y：peak area；X：mass concentration，μg/L

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用所建立的分析方法對(duì)3份芬太尼注射液樣品進(jìn)行檢測(cè)，均檢出高濃度芬太尼，質(zhì)量濃度分別為47.1、47.8、48.1 mg/L。

3 結(jié) 論

本文采用75%乙腈水溶液結(jié)合乙腈提取固體和液體藥物中27種芬太尼類物質(zhì)，固體藥物提取液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，液體藥物提取液經(jīng)QuEChERS法凈化后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，溶劑用量少，靈敏度高，穩(wěn)定性好；具有較高的回收率、良好的精密度和較低的定量下限，適用于頭痛粉、止咳水等藥物中芬太尼類物質(zhì)的定性及定量檢測(cè)，滿足公安緝毒、刑偵及相關(guān)檢測(cè)部門對(duì)芬太尼監(jiān)控的檢測(cè)技術(shù)要求，具有迫切的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值。