高強度聚焦超聲聯(lián)合全氟戊烷液滴在乳腺癌治療增效中的實驗研究

余倩，高乙惠，許萍萍，姚一靜，王芮，陳旖旎，姜立新

高強度聚焦超聲聯(lián)合全氟戊烷液滴在乳腺癌治療增效中的實驗研究

余倩，高乙惠，許萍萍，姚一靜，王芮，陳旖旎，姜立新

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院，上海 200030)

探討高強度聚焦超聲(High-Intensity Focused Ultrasound, HIFU)聯(lián)合全氟戊烷液滴(Perfluoropentane droplets, PFP)，對小鼠乳腺癌4T1細胞治療的增效作用。制備PFP，檢測其平均粒徑及形態(tài)結(jié)構(gòu)。試驗設(shè)立三組：HIFU假照組，單純HIFU治療組，HIFU聯(lián)合PFP治療組。流式細胞儀檢測HIFU分組治療乳腺癌細胞后細胞存活率及死亡率；體內(nèi)動物試驗分組處理后，二維超聲觀察HIFU輻照前后腫瘤回聲灰度變化情況，超聲造影劑灌注缺損面積占總面積百分比評價不同治療方式對裸鼠皮下移植瘤的消融能力。所制備的PFP平均粒徑為1.2 μm，形態(tài)呈規(guī)則球形。細胞試驗顯示，HIFU聯(lián)合PFP治療組乳腺癌細胞死亡率(23.50±1.34)%顯著高于單純HIFU治療組(14.34±0.55)%和HIFU假照組(11.76±0.62)%(<0.05)；動物試驗顯示HIFU聯(lián)合PFP治療組腫瘤消融面積占總面積百分比(84.03±4.47)%顯著高于單純HIFU治療組(41.23±4.24)%(<0.05)，HIFU假照組無明顯灌注缺損區(qū)域。HIFU聯(lián)合PFP可顯著增強對乳腺癌細胞及組織的消融能力。

高強度聚焦超聲；乳腺腫瘤；全氟戊烷液滴；治療

0 引言

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，在中國城鄉(xiāng)女性常見癌癥中排第五位[1]。目前，乳腺癌的微創(chuàng)治療包括冷凍消融、射頻消融、激光消融、微波消融和高強度聚焦超聲(High-Intensity Focused Ultrasound, HIFU)消融[2-4]。

全氟戊烷液滴(Perfluoropentane droplets, PFP)具有液氣相變的特性，其常溫下為液體狀態(tài)，溫度升高或高強度超聲輻照能使其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，該過程也被稱為聲致相變效應(Acoustic Droplet Vaporization, ADV)[5]，HIFU作用下PFP可產(chǎn)生氣泡，聲波下氣泡的振蕩和破裂可增強HIFU治療空化效應，提高產(chǎn)熱能力，潛在地增強HIFU消融效率[6-7]。本試驗從細胞及動物兩個層面，探討HIFU聯(lián)合PFP在乳腺癌治療增效中的可行性及有效性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

主要儀器：細胞培養(yǎng)箱(Hyclone, 美國)，流式細胞分析儀(Beckman Coulter, 美國)，小動物脈沖型聚焦超聲腫瘤治療儀(無錫海鷹電子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司)，超聲診斷儀(MyLabTM90, Esaote, 意大利)。

主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco, 美國)，胰蛋白酶(Gibco, 美國)，PBS緩沖液(Gibco, 美國)，胎牛血清(Ausbian, 澳大利亞)，青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone, 美國)，活細胞/死細胞雙染試劑盒(Calcein-AM/PI, 中國上海貝博公司)，超聲造影劑(SonoVue, Milan, 意大利)。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng)

鼠源性乳腺癌4T1細胞株購于中國科學院上海典藏細胞庫，乳腺癌細胞為貼壁生長。使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺癌4T1細胞，培養(yǎng)基中含1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液，9%胎牛血清，細胞放置于37°C飽和濕度及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。當4T1細胞達到對數(shù)生長期時進行消化離心制備成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，細胞實驗時使用六孔板培養(yǎng)細胞，每個孔中加入2 mL配置好的RPMI-1640培養(yǎng)基及1×105個乳腺癌4T1細胞。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳腺癌皮下移植瘤模型構(gòu)建

模型采用裸鼠(Balb/c nude mice)作為實驗動物(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，SCXK(滬)2013-0016)，約6周齡，飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動物房無特定病原體(Specific Pathogen Free, SPF)級屏障設(shè)施中。鼠源性乳腺癌4T1細胞作為瘤源，將對數(shù)生長期的4T1細胞制成細胞懸液，1 mL PBS重懸后用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，于裸鼠背部皮下注射約每200 μL 5×106～10×106個的細胞量。用手固定小鼠，75%乙醇棉球消毒小鼠背部皮膚，后將細胞懸液注射到小鼠右側(cè)背部皮下形成皮丘，緩慢退針，確保穿刺點無液體滲出。注射后每天持續(xù)觀測瘤鼠狀態(tài)及腫瘤生長情況，定期測量裸鼠腫瘤的最長徑(單位mm)、最寬徑(單位mm)。

1.3.2 全氟戊烷液滴制作

實驗所用的相變?nèi)焱橐旱?PFP)制備與文獻[8-9]所用方法相同。簡而言之，25%全氟戊烷(Strem Chemicals, 美國)和75%脂質(zhì)在聲振儀細胞破碎儀(450 Digital Sonifier, 美國)中處理30 s，設(shè)置功率為10 W。所得混合溶液于4°C儲存。實驗前采用庫爾特粒度儀(Beckman Coulter, 美國)對稀釋一萬倍后的液滴數(shù)目及直徑進行測量，所測液滴的平均粒徑為1.2 μm，其中99%的粒徑小于3 μm。在用于實驗之前，使用PBS將液滴密度稀釋至每mL 1.5×107個的細胞量。顯微鏡下全氟戊烷微滴照如圖1所示。

圖1 顯微鏡下全氟戊烷微滴照(標尺20 μm)

1.3.3 小動物HIFU腫瘤治療儀參數(shù)

治療探頭工作頻率：4.00 MHz，焦距：11.5 mm，焦域橫向尺寸(-6 dB)：0.78 mm× 0.57 mm，焦域縱向尺寸(-6 dB)：9.2 mm，最大輸出功率：29.05 W，最大聲強：8.14×103W·cm-2。

1.3.4 細胞試驗HIFU分組治療及流式細胞儀檢測

按上述方法將4T1細胞置于六孔板內(nèi)，分為HIFU假照組，單純HIFU治療組和HIFU聯(lián)合PFP治療組，每組各6孔。實驗方法：(1) HIFU假照組，HIFU假照；(2) 單純HIFU治療組，孔內(nèi)加入生理鹽水0.1 mL，輸入前述固定參數(shù)輻照30次；(3) HIFU聯(lián)合PFP治療組，孔內(nèi)加入0.1 mL稀釋后的PFP，輸入前述固定參數(shù)輻照30次。HIFU輻照實景圖如圖2所示，為了減少六孔板內(nèi)輻照能量的衰減，避免探頭直接接觸六孔板底部，探頭與孔板之間放置厚度為5 mm的導聲墊。

HIFU輻照后將不同分組的細胞放置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，對瓶內(nèi)細胞進行消化離心(轉(zhuǎn)速為1000 r·min-1，時長為5 min)，并用PBS多次洗滌細胞后，按照活細胞/死細胞染色試劑盒操作說明，加入Calcein-AM染色液避光孵育15～30 min后再加入PI染色劑孵育1~5 min，用PBS多次洗滌細胞后重懸，使用流式細胞儀上機檢測。熒光特性如下，Calcein-AM: 激發(fā)波長E=490 nm, 發(fā)射波長E=515 nm; PI:E=535 nm,E=617 nm。

圖2 HIFU 輻照乳腺癌細胞實景圖

1.3.5 荷瘤鼠的HIFU分組治療及超聲評價

荷瘤裸鼠(Balb/c)30只，雌性，約6周齡，腫瘤生長至28 d(最長徑約8～10 mm，開始治療)，隨機分為HIFU假照組，單純HIFU治療組和HIFU聯(lián)合PFP治療組，每組各10只。實驗方法：碘伏常規(guī)消毒后，1%無巴比妥鈉10 μL·g-1腹腔注射麻醉，麻醉起效后進行分組治療：(1) HIFU假照組，腫塊表面涂以超聲耦合劑，HIFU假照；(2) 單純HIFU治療組，尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL，30 min后腫塊表面涂以超聲耦合劑，輸入前述固定參數(shù)輻照30次；(3) HIFU聯(lián)合PFP治療組，尾靜脈注射稀釋后的PFP 0.1 mL，30 min后腫塊表面涂以超聲耦合劑，輸入前述固定參數(shù)輻照30次。

治療前后分別使用二維超聲觀察腫塊大小形態(tài)及回聲灰度變化情況，HIFU治療結(jié)束后即刻進行超聲造影(MyLabTM90, Esaote, Italy, 12 MHz線陣探頭)。首先，在二維模式下確定腫瘤位置，并在瘤鼠尾靜脈插入一根靜脈輸液針。隨后，混勻超聲造影劑，將0.2 mL造影劑通過尾靜脈以團狀注射方式注入，以1 mL生理鹽水沖管。選取皮下瘤最大橫截面作為觀察平面，并在造影劑注射時啟動視頻錄制。造影結(jié)束后，選取最大橫截面用Image J軟件計算腫瘤充盈缺損區(qū)域面積。

1.4 統(tǒng)計分析

2 實驗結(jié)果

2.1 細胞試驗結(jié)果

流式檢測結(jié)果圖3所示，橫坐標為Calcein-AM染色結(jié)果，陽性代表活細胞；縱坐標為PI染色結(jié)果，陽性代表死細胞。圖4的結(jié)果表明，HIFU假照組細胞存活率最高(88.62±0.62)%，死亡率最低(11.76±0.62)%，其次為單純HIFU治療組，存活率為(85.66±0.55)%，死亡率為(14.34±0.55)%，HIFU聯(lián)合PFP治療組細胞存活率最低(75.94±1.34)%，死亡率最高為(23.50±1.34)%，進行兩兩比較，各組間的細胞存活和死亡率均具有統(tǒng)計學意義(<0.05)。

圖3 流式細胞儀檢測圖

圖4 不同組活細胞及死細胞百分比(%)

2.2 動物試驗結(jié)果

單純HIFU治療組和HIFU聯(lián)合PFP治療組腫瘤消融面積百分比如圖5所示，HIFU聯(lián)合PFP治療組腫瘤充灌注損面積占總面積百分比(84.03±4.47)%，顯著高于單純HIFU治療組(41.23±4.24)% (<0.05)。圖6顯示了HIFU治療前后腫瘤的二維超聲及超聲造影圖像。3組腫瘤區(qū)域HIFU治療前，二維超聲均表現(xiàn)為形態(tài)規(guī)則，邊界清晰的均勻低回聲區(qū)。HIFU假照組超聲造影表現(xiàn)為造影劑在腫塊內(nèi)快速而均勻地強化，無灌注缺損區(qū)(圖6中a1、a2、a3)；單純HIFU治療組治療后二維超聲可見腫塊內(nèi)點狀、小片狀回聲增高區(qū)，超聲造影顯示腫塊中心少量灌注缺損區(qū)，周圍呈環(huán)形強化(圖6中b1、b2、b3)；HIFU聯(lián)合PFP治療組，HIFU輻照后二維超聲觀察到腫塊回聲的顯著變化，呈均勻高回聲，超聲造影顯示腫塊大部分區(qū)域無造影劑灌注，周邊見少量環(huán)形強化(圖6中c1、c2、c3)。

圖5 單純HIFU治療組和HIFU聯(lián)合PFP治療組腫瘤消融面積百分比

圖6 荷瘤鼠HIFU治療前后二維超聲及超聲造影圖像(箭頭所示為HIFU輻照區(qū)域，標尺 5 mm)

3 討論

HIFU消融作為乳腺癌局部微創(chuàng)治療的手段[10]，與射頻消融等相比具有非侵入性的特點，其消融腫瘤組織的機制主要為機械效應、空化效應及熱效應，并可以與放療及化療等結(jié)合使用以增強腫瘤治療效果[11-12]。

在臨床工作中，由于組織聲衰減，使得治療較大的實體腫瘤時需要更高的聲能和更長的時間，為了提高HIFU在乳腺腫瘤中的臨床效用，需要增加HIFU消融效率以及縮短治療時間，減少患者痛苦和并發(fā)癥的發(fā)生率，HIFU增效劑的研究逐漸引起重視。相變型液態(tài)氟碳材料受到研究者的關(guān)注[13]，該材料可在HIFU的高聲壓和產(chǎn)熱作用下，發(fā)生相變產(chǎn)生氣泡，作為外源性空化核，能降低空化閾值促進空化發(fā)生，氣泡的非線性振動有利于超聲產(chǎn)生熱量，可在超聲作用下爆破產(chǎn)生機械效應導致細胞損傷，引起腫瘤微血管的破裂提高HIFU療效，并且氣泡相互融合可阻塞微血管，造成腫瘤內(nèi)部缺氧的同時減少腫瘤細胞進入血液循環(huán)[14]。

Zhang等[15]使用含白蛋白的凝膠模塊，通過對白蛋白變性情況的觀察來判斷HIFU聯(lián)合相變納米乳劑治療效果，研究發(fā)現(xiàn)納米乳劑產(chǎn)生的氣泡可顯著減少凝膠模塊中蛋白變性所需的時間及聲功率。王修杰等[16]使用不同強度的HIFU處理人乳腺癌細胞MCF-7，觀察到HIFU作用下細胞增殖減少，凋亡增加及熱休克蛋白的表達增加，表明HIFU具有明顯損傷癌細胞及抑制其生長的作用。本試驗使用同等強度的HIFU輻照小鼠乳腺癌4T1細胞，增加了HIFU聯(lián)合PFP治療，結(jié)果顯示聯(lián)合治療相較于單純HIFU治療可顯著提高乳腺癌細胞死亡率，試驗表明HIFU聯(lián)合PFP治療在細胞層面具有增效作用，為進一步進行體內(nèi)驗證打下基礎(chǔ)。

Gao等[17]通過超聲造影評價臨界溫度聚焦超聲(sub-threshold focused ultrasound, FUS)消融裸鼠皮下瘤效果，與MRI相較，超聲造影具有實時動態(tài)顯像，簡便易操作及耗時短等優(yōu)點，并且造影劑無灌注區(qū)能很好地顯示腫瘤內(nèi)部壞死區(qū)域。陳莉等[18]使用超聲造影劑評價高強度聚焦超聲治療骨腫瘤的療效，治療區(qū)域顯示為造影劑灌注缺損區(qū)，而未治療的腫瘤組織仍有超聲造影劑灌注，結(jié)果表明超聲造影成像能清楚地顯示腫瘤范圍及治療后灌注缺損區(qū)的大小。本研究利用二維超聲及超聲造影評價裸鼠皮下移植瘤HIFU治療效果，結(jié)果顯示相同HIFU治療參數(shù)下，HIFU聯(lián)合PFP治療后腫瘤內(nèi)部灌注缺損面積占總腫瘤面積百分比顯著高于單純HIFU治療，試驗表明HIFU聯(lián)合PFP治療在動物體內(nèi)具有增效可行性。

綜上所述，本試驗通過細胞及動物兩個層面驗證了HIFU聯(lián)合PFP在乳腺癌治療增效中的可行性及有效性，為臨床實踐提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

本研究針對相同HIFU輻照參數(shù)聯(lián)合相同濃度PFP對乳腺腫瘤消融的影響，未涉及HIFU強度變化及PFP濃度變化。在后續(xù)研究中，可設(shè)置不同HIFU輻照強度與不同PFP濃度的組合，進一步對HIFU聯(lián)合PFP消融乳腺癌細胞及組織的最佳協(xié)同劑量進行研究。

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Treatment of breast cancer using perfluoropentane droplets enhanced high-intensity focused ultrasound: an experimental study

YU Qian, GAO Yihui, XU Pingping, YAO Yijing, WANG Rui, CHEN Yini, JIANG Lixin

(Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai 200030, China)

To investigate the synergistic effect of high-intensity focused ultrasound (HIFU) combined with perfluoropentane droplets (PFP) on the treatment of mouse breast cancer 4T1 cells.PFP were prepared and their average particle size and morphology were examined. Three groups were set up in the experiment: blank control group, HIFU treatment group, HIFU combined with PFP treatment group, and the ability of HIFU combined with PFP for increasing the efficacy of 4T1 cells therapy in vitro was detected by flow cytometry; B-mode ultrasound was used to observe the gray changes before and after HIFU ablation and the percentage of perfusion defect in contrast-enhanced ultrasound to evaluate the synergistic ablation ability of HIFU combined with PFP for subcutaneously transplanted tumors in nude mice.The average particle size of the prepared PFP was 1.2 μm, and the shape was regular spherical. Cell tests showed that 4T1 cells mortality (23.50 ± 1.34)% in the HIFU combined with PFP treatment group was significantly higher than that in the HIFU-treated group alone (14.34 ± 0.55)% and that in the HIFU sham group (11.76 ± 0.62)%, (P <0.05). Animal experiments showed that the percentage of tumor necrotic area in the HIFU combined with PFP treatment group (84.03 ± 4.47)% was significantly higher than that in the HIFU treatment group alone (41.23 ± 4.24)%, (P <0.05), there was no obvious perfusion defect in the blank control group.HIFU combined with PFP can significantly enhance the ablation ability of breast cancer cells and tissues.

high-intensity focused ultrasound; breast cancer; perfluoropentane droplets; treatment

TB559

A

1000-3630(2020)-02-0195-05

10.16300/j.cnki.1000-3630.2020.02.012

2020-01-02;

2020-02-15

國家自然科學基金面上項目(81771850)、上海交通大學醫(yī)工交叉基金(YG2017MS19)資助項目。

余倩(1993－), 女, 重慶人, 碩士研究生, 研究方向為腫瘤的超聲治療。

姜立新, E-mail: jinger_28@sina.com