五味枳椇顆粒有效成分提取工藝的研究

王子林，張宏梅，何昌盛，崔佰吉,韓在祺

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

近年來飲酒導(dǎo)致的肝炎、肝硬化等肝損傷類疾病成逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，給人們的日常生活帶來極大的麻煩，也給患者和患者家屬帶來極大的痛苦。解酒保肝類保健產(chǎn)品對(duì)酒精性肝損傷有一定的療效，在預(yù)防和治療酒精性肝損傷方面起到一定的積極作用，在生活中越來越受到人們的重視。五味枳椇顆粒采用五味子、枳椇、葛根、葛花和甘草為主要原料，添加一定的輔料制備成顆粒制劑，具有抗肝纖維化，恢復(fù)肝臟機(jī)能，促進(jìn)膽汁分泌作用，對(duì)防止脂肪在肝臟堆積也有一定的療效[1-5]。本研究通過乙醇回流提取五味枳椇的有效成分，以葛根素、甘草酸銨、五味子醇甲、楊梅素為效標(biāo),用高效液相測(cè)定其含量，優(yōu)化最佳提取工藝，為五味枳椇顆粒進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色色譜儀(日本)；ESJ200-4B電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司)；Scientz-12SN冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

葛根、甘草、五味子、葛花均購(gòu)自吉林市德仁藥材行；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法建立

2.1.1色譜條件

色譜柱：Agilent TC-2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH 6.5)，梯度洗脫(0→30→50→60→75 min，86%→20%→20%→86%→86%乙腈)；流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取五味子醇甲2.28 mg、甘草酸銨1.81 mg、葛根素4.78 mg、雙氫楊梅素1.28 mg，置于50 mL的容量瓶中，甲醇溶解、定容得混合標(biāo)準(zhǔn)品。

2.1.3供試品溶液的制備

精密稱取提取物粉末2.0 g，置50 mL容量瓶中，加40 mL甲醇，超聲處理30 min，加甲醇定容至刻度，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液、即得。

2.2 單因素考察

將枳椇、葛根、葛花、甘草、五味子按5∶3∶1∶1∶1的比例進(jìn)行取樣，分別對(duì)提取中的影響因素提取時(shí)間、乙醇濃度和藥液比例進(jìn)行單因素考察，確定影響因素的趨勢(shì)。

2.2.1提取時(shí)間的考察

按處方量稱取藥材3份，料液比為1∶10，乙醇濃度為70%的條件下，進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，提取時(shí)間分別1.0、2.0、3.0 h,提取液濃縮，冷凍干燥，得提取物粉末，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行出膏率的檢查。結(jié)果顯示：隨著加熱時(shí)間的增加，含量與出膏率也隨之加大，但增加的幅度減小，考慮到能源的利用率，所以2 h為最佳的加熱時(shí)間。

2.2.2乙醇濃度的考察

按處方量稱取藥材4份，回流時(shí)間為2 h，1∶10料液比例進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%,提取液濃縮，冷凍干燥，得提取物粉末，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行出膏率的檢查。結(jié)果可知乙醇濃度為60%時(shí)藥液的含量最高，出膏率最大，所以最佳的乙醇濃度為60%。

2.2.3液-料比例的考察

按處方量稱取藥材5份，回流時(shí)間為2 h，乙醇濃度為60%，進(jìn)行六組提取實(shí)驗(yàn)，液-料比分別為8、10、12、14、16倍，提取液濃縮，冷凍干燥，得提取物粉末，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行出膏率的檢查。結(jié)果顯示：料液比為14倍時(shí)，藥液含量最高，料液比為12倍時(shí)，出膏率最大，但料液比過高時(shí)浪費(fèi)資源，當(dāng)料液比為10倍時(shí)，含量和出膏率都接近最大量，所以料液比為10倍時(shí)為最佳條件。

2.2.4提取次數(shù)的考察

按處方量稱取藥材3份，在回流時(shí)間1.5 h、乙醇濃度為60%、液-料比為10倍的條件下提取，提取液濃縮，冷凍干燥，得提取物粉末，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行出膏率的檢查。結(jié)果表明,提取次數(shù)增加，有效成分的含量有所增加，但是增加比例不是很大，綜合考慮，選擇提取2次為本研究的工藝。

2.3 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素考察的結(jié)果,進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),因素水平見表1,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。正交試驗(yàn)表明最佳實(shí)驗(yàn)組合為A2B1C3，方差分析表明，因素A為顯著因素，因素B、C不顯著。但從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)考慮，C1和C3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，但C3加熱時(shí)間越長(zhǎng)，能源消耗較大，同時(shí)考慮提取效率問題，所以選C2。因此最佳工藝為A2B1C2,即為乙醇濃度為60%，料液比為10倍，加熱時(shí)間為2 h。

表 1 因素水平表

表 2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

注：綜合評(píng)分=百分含量×0.6+出膏率×0.4

2.4 工藝驗(yàn)證

按處方量稱取藥材3份，60%的乙醇溶液，8倍量，回流提取2 h，提取2次，提取液濃縮，冷凍干燥，得提取物粉末，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行出膏率的檢查。按照正交實(shí)驗(yàn)的最佳條件做3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，表明穩(wěn)定性較好達(dá)到了質(zhì)量要求,實(shí)驗(yàn)工藝可行。

3 討 論

在多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)中，各指標(biāo)的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案之間可能存在一定的矛盾，所以在實(shí)驗(yàn)中要兼顧各個(gè)指標(biāo)，找出各個(gè)指標(biāo)都較好的方案。綜合評(píng)分法是根據(jù)各個(gè)指標(biāo)的重要性來確定權(quán)重或組合系數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中含量占60%，出膏率占40%來評(píng)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以綜合評(píng)分法優(yōu)化的最佳提取工藝提取效率更高。

本研究在考察有效成分提取工藝的過程中,在預(yù)實(shí)驗(yàn)的過程中進(jìn)行了可以代表幾種原料的有效成分：五味子醇甲、葛根素、雙氫楊梅素和甘草酸銨。可以充分顯示每種藥材在方中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)于復(fù)雜的多組分保健食品在內(nèi)控質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)提升上具有一定的科學(xué)依據(jù)，也在本制劑的技術(shù)保障上起到一定的作用。同時(shí)課題組對(duì)于幾種有效成分的含量測(cè)定方法進(jìn)行了HPLC的方法學(xué)建立，并進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)研究。研究表明該方法快速、簡(jiǎn)單，方法學(xué)驗(yàn)證合理，可以用于作為本制劑中4種有效成分的含量測(cè)定。