不同分子量透明質(zhì)酸對(duì)肺癌小鼠體內(nèi)腫瘤生長轉(zhuǎn)移的影響

郝利銘，姜 晶，趙廣鑫，李永超，桑 赫，韓雨桐

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130021;2.吉林省腫瘤醫(yī)院,吉林 長春 130012)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)廣泛分布于細(xì)胞間質(zhì)中，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成員之一。近年來的研究表明，腫瘤細(xì)胞周圍富含HA，它們大多由腫瘤細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。王玲研究顯示[1]，天然高分子量HA可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，這可能與高分子量HA的理化性質(zhì)有一定關(guān)系。此外，Ghatak等研究發(fā)現(xiàn)[2]，外源性低分子量HA(分子量約2.5×106Da)在體外可抑制小鼠TA3/st乳腺癌細(xì)胞、大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、人HCT克隆瘤細(xì)胞及人LX1肺癌細(xì)胞生長，抑制率在50%～100%。而HA含量的多少對(duì)腫瘤生長同樣產(chǎn)生著影響。Bharadwaj等研究發(fā)現(xiàn)[3]，HAS3所致過量HA可能誘導(dǎo)并改變前列腺惡性腫瘤細(xì)胞生長所需的平衡。

人體內(nèi)HA是由透明質(zhì)酸合酶(hyaluronic acid synthase，HAS)與透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HAases)共同作用所形成的[4]。HAS是HA在生物合成過程中的關(guān)鍵酶。HAS的功能失調(diào)能夠?qū)е翲A合成下降，促進(jìn)細(xì)胞和組織的生理過程向異常轉(zhuǎn)化。研究表明，在大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌的腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，HAS起到重要的作用[5]。HAases在腫瘤生長轉(zhuǎn)移過程中也起了重要作用。HAases通過降解腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)中的HA，幫助腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤塊；其次，癌細(xì)胞還利用HAases降解淋巴和血管基底膜，更容易進(jìn)入血管內(nèi)；此外，HAases通過分解轉(zhuǎn)移灶附近的HA，為轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞遷移與轉(zhuǎn)移提供空間。在所有的HAases分解HA過程中，都會(huì)不斷產(chǎn)生HA片段。這些HA片段刺激了內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生毛細(xì)血管生長，從而促進(jìn)了腫瘤的擴(kuò)散[6-7]。

本研究擬通過給C57BL/6肺癌小鼠注射低、中、高三種分子量大小HA溶液，觀察不同分子量HA對(duì)肺癌小鼠體內(nèi)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的影響，以探究HA作為注射劑抑制或治療部分腫瘤的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

C57BL/6健康小鼠50只(SPF級(jí))，雄性，6～8周齡，體重(21.15±0.75)g，長春生物制品所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系(LLC)細(xì)胞，由吉林大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)研究室提供。不同分子量大小的透明質(zhì)酸鈉：0.2×106～0.4×106Da(低分子量)、1.3×106～1.5×106Da(中分子量)、1.8×106～2.2×106Da(高分子量)透明質(zhì)酸鈉，由華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司提供。本實(shí)驗(yàn)所有切片圖片均采用EUROStarⅢPlus顯微鏡行顯微攝影。

1.2 肺癌小鼠模型的建立

消化、收集小鼠LLC細(xì)胞，離心，去上清，無菌生理鹽水洗滌2～3次，制成LLC細(xì)胞懸液。將此細(xì)胞懸液以0.2 mL/只(細(xì)胞含量1×106/mL)分別注入50只健康雄性小鼠大腿右側(cè)腹股溝皮下。注射后小鼠正常飼養(yǎng)21 d，形成米粒大小的腫瘤，第22天開始為小鼠注射HA，注射HA溶液濃度1 g/L[8-9]。

1.3 肺癌小鼠皮下注射HA

將培養(yǎng)的肺癌小鼠模型50只，隨機(jī)分成低(HA1)、中(HA2)、高(HA3)分子量HA組,生理鹽水(NS)組和無注射(CK)組，每組10只。前3組分別在肺癌小鼠右側(cè)腹股溝腫瘤團(tuán)塊的近心端皮下注射低、中、高分子量HA溶液，NS組也于腹股溝處注射生理鹽水0.2 mL，每3天注射1次，CK組不進(jìn)行任何處理。每次給藥后稱量體重，觀察注射局部有無異常狀況。第25天處死所有動(dòng)物，對(duì)小鼠的肝、肺、腦、腎以及腫瘤取材、稱重。

1.4 小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況觀察

將所取材料投入4%中性甲醛固定24 h。固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片。切片厚度 5 μm，備用。取上述切片行常規(guī)HE染色,并分別進(jìn)行胱天蛋白酶(caspase)-3、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、HAS2和HAases2免疫組織化學(xué)染色。顯微鏡觀察所有腫瘤切片的免疫組化結(jié)果，并根據(jù)鏡下觀察的陽性情況將結(jié)果分為3級(jí)：零級(jí)(陰性)記0分、一級(jí)(陽性)記1分、二級(jí)(強(qiáng)陽性)記3分。以評(píng)分的高低顯示一個(gè)組整體的陽性情況,陽性分?jǐn)?shù)=(b+3c)/(a+b+c)，公式中a、b、c分別代表一組中零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)例數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。當(dāng)數(shù)據(jù)例數(shù)足夠多時(shí)用Pearson卡方分析，當(dāng)數(shù)據(jù)例數(shù)少或出現(xiàn)個(gè)別例數(shù)為0時(shí)采用Fisher的精確檢驗(yàn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各分子量HA的刺激性觀察

在小鼠右側(cè)腹股溝皮下注射各分子量HA，48 h后觀察局部組織并未出現(xiàn)充血、水腫及硬結(jié)等異常變化。提示各分子量HA溶液濃度為1 g/L時(shí)安全、無毒性。

2.2 肺癌小鼠主要臟器重量和臟體比

與NS組相比，HA1組和HA3組的肝重量顯著增高(P<0.05)，HA3組的肺重量顯著增高(P<0.05)，HA3組肝的臟體比顯著增高(P<0.05)。其他各組臟器重量和臟體比無顯著差異(P>0.05)。

2.3 肺癌小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移情況

采用下列評(píng)分法進(jìn)行肺癌小鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移分析：無轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為0)、普通轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移灶數(shù)量小于2)和重度轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移灶數(shù)量大于2)。結(jié)果顯示：NS組中9例普通轉(zhuǎn)移，1例重度轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率27.8%；HA1組中7例普通轉(zhuǎn)移，3例重度轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率27.8%；HA2組中11例普通轉(zhuǎn)移，2例重度轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率28.1%；HA3組中14例普通轉(zhuǎn)移，6例重度轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率55.6%。HA3組腫瘤轉(zhuǎn)移顯著高于NS組(P<0.05)，HA1組與HA2組皆與NS組無顯著差異(P>0.05)。

器官轉(zhuǎn)移主要行肝轉(zhuǎn)移，NS組5例普通轉(zhuǎn)移，1例重度轉(zhuǎn)移，重度轉(zhuǎn)移率11.1%;HA1組肝臟5例普通轉(zhuǎn)移，3例重度轉(zhuǎn)移，重度轉(zhuǎn)移率33.3%;HA2組7例普通轉(zhuǎn)移，2例重度轉(zhuǎn)移，重度轉(zhuǎn)移率22.2%;HA3組2例普通轉(zhuǎn)移，6例重度轉(zhuǎn)移，重度轉(zhuǎn)移率66.7%。HA3組腫瘤轉(zhuǎn)移情況比NS組嚴(yán)重，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且高分子量HA促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移，而對(duì)肺和腎無顯著影響(圖1)。

圖 1 各組腫瘤生長轉(zhuǎn)移情況

2.4 肺癌小鼠腫瘤生長狀況

肺癌小鼠腫瘤組織的PCNA免疫組化(圖2)評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：HA2組陽性程度顯著低于NS組(P<0.05，圖3)。HA1組和HA3組皆與NS組無顯著差異(P>0.05)。

肺癌小鼠腫瘤組織的caspase-3免疫組化(圖4)評(píng)分分析結(jié)果顯示：各種分子量大小HA在一定程度上都可以促進(jìn)部分腫瘤細(xì)胞的凋亡(圖5)。

2.5 肺癌小鼠腫瘤周圍HAS2與HAases2分析

肺癌小鼠腫瘤組織的HAS2免疫組化評(píng)分結(jié)果顯示：高分子量HA在一定程度上抑制了腫瘤周圍HAS的合成(圖6、7)。

肺癌小鼠腫瘤組織的HAases2免疫組化評(píng)分統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：各分子量大小HA對(duì)腫瘤周圍HAases的合成并不產(chǎn)生太大影響(圖8)

2.6 HAS2染色陽性分?jǐn)?shù)和腫瘤轉(zhuǎn)移率對(duì)比

HA3組HAS2陽性分?jǐn)?shù)最低、CK組和NS組最高，提示：高分子量組的HA合成最少，而轉(zhuǎn)移率最高(見圖9)。

圖 2 各組腫瘤組織PCNA染色

圖 3 各組腫瘤PCNA染色陽性程度

圖 4 各組腫瘤組織caspase-3染色

圖 5 各組腫瘤caspase-3染色陽性程度

圖 6 各組腫瘤組織PCNA染色

圖 7 各組腫瘤PCNA染色陽性程度

圖 8 各組腫瘤組織caspase-3染色

圖 9 各組HAS2染色陽性分?jǐn)?shù)和腫瘤轉(zhuǎn)移率對(duì)比

3 討 論

近年來研究表明，HA的含量和分子量大小對(duì)癌癥的治療有重要意義。Yamada等研究發(fā)現(xiàn)[10]，HA的作用可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、生長和分化有關(guān)。Bharadwaj的研究結(jié)果提示：HAS3上調(diào)所致的過量HA可能誘導(dǎo)改變前列腺惡性腫瘤細(xì)胞生長所需的平衡。因此，HA分子量大小、腫瘤周圍含量的多少，均影響腫瘤的生長與發(fā)展。

為探究HA治療或抑制部分腫瘤的可行性，本研究采用了皮下注射不同大小分子量HA溶液的方法觀察肺癌小鼠體內(nèi)腫瘤在實(shí)驗(yàn)過程中的生長與轉(zhuǎn)移情況。

腫瘤的生長是腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡綜合的結(jié)果：當(dāng)細(xì)胞增殖大于凋亡時(shí)，表現(xiàn)為腫瘤生長，反之，則抑制腫瘤生長。在腫瘤生長到一定程度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞生長的分析顯示：中分子量HA增殖小于凋亡，很好地抑制了腫瘤的生長；而高分子量HA增殖和凋亡相近，對(duì)腫瘤生長的抑制作用不明顯。所以，從抑制腫瘤生長效果的角度來看，高分子量HA是不及中分子量HA的。

各分子量大小HA的注射，對(duì)于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響也變得不同。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的結(jié)果顯示：皮下注射高分子量HA的小鼠，其體內(nèi)發(fā)生了更多腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。從單個(gè)器官來看，高分子量HA可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向肝臟甚至其他臟器的轉(zhuǎn)移，并且加重了各個(gè)臟器的腫瘤轉(zhuǎn)移嚴(yán)重程度。故而外源性高分子量HA對(duì)腫瘤不存在治療和抑制效果，甚至有可能促進(jìn)了腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。

HA的產(chǎn)生與腫瘤的轉(zhuǎn)移也存在一定的聯(lián)系。從對(duì)腫瘤細(xì)胞周圍HAS2的分析顯示：腫瘤的轉(zhuǎn)移率的增高，與HAS2表達(dá)的減少是有著一定相關(guān)性的，但這種相關(guān)性的機(jī)制還并未確定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)一系列HA溶液皮下注射的研究，發(fā)現(xiàn)了中分子量HA相比于其他兩種分子量HA，有著良好的抑制腫瘤生長效果，同時(shí)也不會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向其他臟器部位的轉(zhuǎn)移。中分子量HA作為細(xì)胞外基質(zhì)成分,具有無毒、安全性高、結(jié)構(gòu)明確、易于生產(chǎn)和價(jià)格便宜等特點(diǎn)。因此本研究提示，中分子量HA可以作為一種新的腫瘤治療研發(fā)方向。但同時(shí)，現(xiàn)階段的研究也存在著局限性。本實(shí)驗(yàn)只將HA皮下注射到已有腫瘤的部位周圍，而并未探究現(xiàn)實(shí)情況中大多數(shù)腫瘤生長部位的隱蔽與復(fù)雜狀況，這為HA的注射與應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)與困難。下一步工作將研究中分子量HA可否通過靜脈注射，依靠血液抵達(dá)目標(biāo)位置產(chǎn)生作用與效能。