基于系統(tǒng)藥理學和分子對接探討葛根抗腫瘤作用機制

閆 浩，劉瀟瀟，宋紅霞，劉亞琦，于春雪

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，陜西 咸陽 712046)

葛根(RadixPuerariae)為豆科植物野葛的干燥根，在解饑退熱、生津、透疹等方面具有顯著的應用價值。近年來，越來越多的研究表明葛根在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，如葛根素對肝癌細胞的生長具有抑制作用[1]、葛根散對小鼠結腸腺癌細胞具有抑制作用[2]等，但有關葛根抗腫瘤機制的研究并不多見。

系統(tǒng)藥理學是將生物信息學、計算機網(wǎng)絡等技術相互融合[3]，揭示疾病與藥物的相互關系，將“一種藥物一種疾病一個基因”的思想轉變?yōu)椤岸嗷?多靶點-復雜疾病”的新思想。分子對接是預測蛋白與配體親和能力和結合模式的強有力的工具，通過對靶點蛋白與小分子親和能力和結合模式的預測[4]，進一步研究其作用機制。

基于系統(tǒng)藥理學和分子對接，作者對葛根在抗腫瘤方面的機制進行研究，為臨床抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論基礎。

1 實驗

1.1 葛根活性成分的篩選

TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology)數(shù)據(jù)庫包括《中華人民共和國藥典》注冊的499種中藥，含有29 384種成分、3 311個靶標和837個相關疾病，它為每種化合物提供了藥物藥代動力學信息，是進行網(wǎng)絡藥理學研究的重要工具[5]。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索葛根的相關參數(shù)，然后查閱文獻[6]并結合實際，以DL≥0.18為篩選標準，篩選葛根的活性成分。

1.2 腫瘤靶點的預測

首先，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Targets Infomation尋找與候選活性成分相關的潛在靶點；然后，使用基因卡片(GeneCards)數(shù)據(jù)庫和在線人類孟德爾遺傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫，以“tumour”為關鍵詞檢索腫瘤靶點，并將兩個數(shù)據(jù)庫檢索到的有效信息合并，去除重復項，與葛根活性成分映射，繪制韋恩圖。

1.3 可視化網(wǎng)絡模型的構建

采用Cytoscape軟件進行可視化分析，對各項屬性進行設置，將葛根、活性成分、對應靶點、疾病導入Cytoscape軟件，構建藥物-成分-靶點-疾病關系圖，將葛根多成分、多靶點的復雜抗腫瘤機制清晰呈現(xiàn)。

1.4 靶點蛋白的篩選

將映射交集基因導入STRING數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為Homo sapiens，設置相互作用分值，下載tsv文件，利用R語言繪制靶點蛋白圖，選取degree值較大的前5個靶點蛋白進行分子對接。

1.5 分子對接

首先，利用PubChem數(shù)據(jù)庫查找葛根候選活性成分的(二維)三維結構，繪制ChemBio3D結構，使用MM2力場進行構象優(yōu)化，轉存為PDBQT格式備用；再在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中查找蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡中degree值最大的5個靶點蛋白，對原PDB蛋白分子進行如下處理：去除水分子、去除復合配體、蛋白分子加氫；最后，利用Scripps研究所Olson課題組開發(fā)的Autodock Vina軟件將葛根的候選活性成分與5個靶點蛋白進行分子對接，選擇能量最低的結合模式利用PyMOL作圖。

1.6 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用Bioconductor進行GO富集和KEGG通路富集分析，得到葛根抗腫瘤作用的主要功能富集和作用通路。

2 結果與討論

2.1 類藥性篩選與疾病-藥物靶標預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到18個葛根化合物。以DL≥0.18為篩選標準，共篩選到16個葛根活性成分，如表1所示。

表1葛根的活性成分

Tab.1 Active ingredients of Radix Puerariae

2.2 韋恩圖及藥物-成分-靶點-疾病關系圖構建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Targets Information，查找到16個葛根候選活性成分的相關靶點共104個；將這些靶點經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢轉化成基因符號格式；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫查找到腫瘤靶點共8 352個，映射得到97個交集基因，如圖1所示。

圖1 韋恩圖Fig.1 Venn mapping

采用Cytoscape軟件將葛根、活性成分、疾病以及交集基因進行可視化分析，繪制葛根抗腫瘤機制的藥物-成分-靶點-疾病關系圖，如圖2所示。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病關系圖Fig.2 Network of drug-ingredient-target-disease

2.3 靶點蛋白的篩選

將映射交集基因復制到STRING數(shù)據(jù)庫中，設置minimum required interaction score>0.8，同時設置隱藏離散的點，下載tsv文件，運用R語言處理，得到靶點蛋白，如圖3所示。

從圖3可知，degree值較大的前5個靶點蛋白分別是：表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、白介素6受體(IL6)、核受體輔激活因子(NCOA1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)。

圖3 PPI中的靶點蛋白Fig.3 Target proteins in PPI

2.4 分子對接

利用Autodock Vina軟件，對16個候選活性成分與degree值較大的5個靶點蛋白(EGFR、ESR1、IL6、NCOA1、VEGFA)進行分子對接，選取結合能最低的最優(yōu)結合模式利用PyMOL作圖，如圖4所示。

從圖4可知，胡蘿卜苷(sitogluside)與EGFR的親和能量最低，親和力最強，其占據(jù)了由Lys745、Thr854、Cys797、Asp800、Pro794殘基組成的活性空腔。羽扇豆酮(lupenone)與ESR1的親和力最強，其占據(jù)了由Tyr526、Leu536、Trp383、Asp351、Ala350、Thr347、Leu525、Cys530殘基組成的活性空腔。大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷(daidzein-4,7-diglucoside)與IL6結合圖中顯示由His105、Gln39、Val93、Pro42、Tyr175、Glu85殘基組成的活性空腔能夠很好地包裹大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷，其7位糖苷上的羥基與Gln39形成氫鍵，4′位糖苷鍵上的羥基與Tyr175、Glu85形成氫鍵。Phe388、Ile397、Leu324、Ala327、Val361、Gln286、Arg364、Leu287、Arg367、Ala368、Phe401構成了NCOA1的活性空腔，β-谷甾醇很好地占據(jù)了NCOA1的活性空腔。VEGFA的活性空腔由Gln22、Tyr21、Tyr25、Cys26、Cys102、HSD27、Pro28組成，羽扇豆酮能夠很好地嵌入空腔結合。

2.5 GO富集分析

利用Bioconductor對葛根PPI網(wǎng)絡中涉及的靶點蛋白進行GO富集分析，生物過程、細胞組分、分子功能均設定pvalueCutoff=0.05、qvalueCutoff=0.05，對前20個的基因富集繪制條形圖，如圖5所示。

圖4 候選活性成分與靶點蛋白的最優(yōu)結合模式Fig.4 Optimal binding mode of candidated active ingredients with target proteins

注：P.adjust值的大小代表富集的顯著性；顏色越深，P.adjust值越小；反之，顏色越淺，P.adjust值越大。

由圖5a可知，靶點蛋白參與類固醇激素、抗生素、活性氧代謝、氧化應激等生物過程；由圖5b可知，靶點蛋白在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、受體復合物、血漿脂蛋白顆粒、囊泡腔、質膜筏等部位均有分布；由圖5c可知，靶點蛋白具有蛋白結合、類固醇結合、核受體活性、轉錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等分子功能。因此可以得出，葛根可能是通過多途徑、多靶點來發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.6 KEGG通路富集分析

利用Bioconductor對PPI網(wǎng)絡中涉及的靶點蛋白經(jīng)R語言進行KEGG通路富集分析，設定pvalueCutoff=0.05、qvalueCutoff=0.05，經(jīng)過R程序運行之后將其中顯著性最大的20條通路富集結果繪制條形圖，如圖6所示。

注：縱軸表示通路名稱，橫軸表示靶點蛋白數(shù)；顏色越深，P.adjust值越小；反之，顏色越淺，P.adjust值越大。

由圖6可知：前列腺癌(prostate cancer)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、p53信號通路(p53 signaling pathway)這3條信號通路與葛根抗腫瘤關系最為密切；除此之外，還得到糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、HIF-1信號通路(HIF-1signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、內分泌抵抗(endocrine resistance)、細胞凋亡(apoptosis)、大腸癌(colorectal cancer)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、蛋白聚糖在癌癥中的信號通路(proteoglycans in cancer)等顯著性較高的17條信號通路，涉及多個靶點蛋白、多條信號通路。說明葛根抗腫瘤是通過多靶點、多途徑發(fā)揮作用。

2.7 討論

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出DL≥0.18的葛根活性成分16個，主要活性成分為胡蘿卜苷、大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷、葛根素、β-谷甾醇、羽扇豆酮等。胡蘿卜苷是一種天然的甾醇類化合物，具有抗腫瘤作用，Lee等[7]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷對人乳腺癌細胞具有顯著的抑制遷移作用且具有劑量依賴性。大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷能使大鼠乳腺腫瘤的微血管密度下降，有效抑制乳腺腫瘤生長[8]。葛根素具有抑制腫瘤細胞周期、調控線粒體途徑、腫瘤細胞凋亡信號途徑，相關研究還表明葛根素純品以及葛根粗提物都能起到誘導小細胞肺癌凋亡的作用[9]。β-谷甾醇能抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡，其抗癌機制可能與β-谷甾醇通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導細胞自噬作用有關[10]。羽扇豆酮為五環(huán)三萜類化合物[11]，也具有抗腫瘤作用。

葛根抗腫瘤作用主要作用于EGFR、ESR1、IL6、NCOA1、VEGFR等5個靶點，主要涉及前列腺癌、人巨細胞病毒感染、p53信號通路。研究表明，細胞內信號傳導通路的異常與前列腺癌的進展與轉移密切相關。Mitchell等發(fā)現(xiàn)AR信號轉導通路能促進前列腺上皮細胞的生長，參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及前列腺癌細胞由雄激素敏感型向抵抗型轉變[12]。人巨細胞病毒是目前已知最大的β皰疹病毒，近年來的研究顯示在結直腸癌[13]、乳腺癌[14]和前列腺癌[15]及小細胞型肝癌等多種類型的腫瘤組織中都存在人巨細胞病毒感染和病毒基因表達，并與腫瘤的惡性程度相關[16]。p53轉錄激活多種線粒體凋亡信號基因，包括Bax、PUMA、NOXA、Apaf-1和Caspase-9，進而促進線粒體膜解體和隨后的Caspase激活[17]。細胞表面的跨膜蛋白與其同源配體結合后，激活細胞內Caspase-8/Caspase-10，最終激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡蛋白酶。這些結果與本研究一致，說明預測結果可靠。

3 結論

通過系統(tǒng)藥理學分析，探討葛根抗腫瘤作用機制；采用分子對接進一步驗證其可靠性。結果表明，多種成分可作用于同一個靶點，同一成分可與多個靶點作用，說明葛根抗腫瘤是通過多成分、多靶點、多途徑作用。通過對靶點蛋白基因分析可知：細胞周期控制和血管生成對其影響較大，且異黃酮類和β-谷甾醇類成分能起到干預作用，為新藥研發(fā)提供了新的途徑和策略。