產(chǎn)前發(fā)熱對新生兒宮內(nèi)細菌感染及臍血 miRNA-155、NF-κB信號通路指標的影響

張麗亞 陳黎麗 羅芳

宮內(nèi)感染是指孕婦在圍生期受病原體感染后致胎兒感染，是引起早產(chǎn)及一系列早產(chǎn)合并癥的重要原因[1]。在新生兒感染中，越來越強調(diào)母體產(chǎn)前發(fā)熱的影響；《新生兒敗血癥診斷及治療專家共識（2019年版）》也強調(diào)了母體產(chǎn)前發(fā)熱的地位[2]。miRNA-155誘導(dǎo)的核因子-κB（NF-κB）信號通路激活促使趨化因子和細胞因子過表達，在炎癥發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。本研究就產(chǎn)前發(fā)熱對新生兒宮內(nèi)細菌感染的影響及及臍血miRNA-155、NF-κB信號通路指標的影響作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1至12月在寧波市婦女兒童醫(yī)院分娩的、產(chǎn)前體溫＞37.5℃、無胎膜早破、經(jīng)嚴格消毒后分娩的單胎孕婦及其新生兒200例為產(chǎn)前發(fā)熱組，同期無產(chǎn)前發(fā)熱但其余條件相同的100例單胎孕婦及其新生兒為健康對照組。產(chǎn)前發(fā)熱組與健康對照組在年齡、孕次、產(chǎn)次、分娩孕周方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 1。排除標準：（1）最近 2 周使用過抗菌藥物；（2）合并嚴重的心、肝、腎等臟器功能障礙性疾??；（3）合并糖尿病及妊娠高血壓疾病。

1.2 方法

1.2.1 絨毛膜炎的診斷 在分娩時，距胎膜破口5cm出取大小約2cm×2cm的胎膜組織，常規(guī)甲醛固定石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。組織學絨毛膜羊膜炎表現(xiàn)為絨毛膜及羊膜組織中有炎性細胞浸潤。

1.2.2 新生兒宮內(nèi)細菌感染的診斷 依據(jù)臨床癥狀及血培養(yǎng)進行確定。判斷標準：血培養(yǎng)陽性，臨床表現(xiàn)為皮膚發(fā)灰、呼吸暫停、呼吸＞60次/min、呼吸功能不全、血壓降低、嗜睡、心動過緩或過速、肌張力減低。

1.2.3 新生兒臍血炎癥指標的檢測 （1）樣本采集：胎兒娩出后、斷臍前采集臍血標本5ml，4℃、3 000r/min離心10min，收集血清，-80℃低溫保存。（2）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測臍血 miRNA-155、p65、p50、NF-κB 復(fù)合物抑制因子 α（IκBα）、IKB 激酶 β（IKKβ）、白細胞介素8（IL-8）的基因表達量：取200μl復(fù)溶的血清于離心管中，加入1ml Trizol試劑充分混勻裂解；分別用氯仿、異丙醇及DEPC水配制的70%乙醇處理；取DEPC-H2O溶解RNA，-80℃低溫保存。使用紫外分光光度計、1%瓊脂糖凝膠電泳分別測定RNA濃度和完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行PCR擴增。miRNA-155（上游引物：GCCTTAATGCTAATCGTGATAG，下游引物：TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT），p65（上游引物：GCGAGAGGAGCACAGATACC，下游引物：CTGATAGCCTGCTCCAGGTC），p50（上游引物：CCTGGATGACTCTTGGGAAA，下游引物：TCAGCCAGCTGTTTCATGTC），IκBα（上游引物：GCAAAATCCTGACCTGGTGT，下游引物：GCTCGTCCTCTGTGAACTCC），IKKβ（上游引物：GCTGCAACTGATGCTGATGT，下游引物：TGTCACAGGGTAGGTGTGGA），IL-8（上游引物：CACCGGAAGGAACCATCTCA，下游引物：AAACTTCTCCACAACCCTCTGC），β-actin（上游引物：CGTGGACATCCGCAAAGAC，下游引物：CATCTGCTGGAAGGTGGACAG）。反應(yīng)條件：94℃變性 2min；94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40個循環(huán)。使用Smart View凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴增帶灰度值，以各目的基因擴增帶灰度值比內(nèi)參照β-actin擴增帶灰度值作為基因相對表達量。（3）酶聯(lián)免疫吸附測定檢測臍血IL-8。超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平，具體操作按試劑說明書進行。

表1 產(chǎn)前發(fā)熱組與健康對照組產(chǎn)孕婦一般資料比較[例（%）]

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前發(fā)熱組與健康對照組絨毛膜炎及新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率比較 產(chǎn)前發(fā)熱組孕婦絨毛膜炎發(fā)生率為68.0%（136/200），明顯高于健康對照組的15.0%（15/100），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率為50.0%（100/200），明顯高于健康對照組的10.0%（10/100），差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 產(chǎn)前發(fā)熱組與健康對照組新生兒臍血炎癥指標比較 產(chǎn)前發(fā)熱組 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8 基因表達量及IL-8。hs-CRP水平均明顯高于健康對照組，IκBα基因表達量低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表 2。

2.3 產(chǎn)前發(fā)熱程度與絨毛膜炎、新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率及新生兒臍血炎癥指標的關(guān)系 以產(chǎn)前1周體溫38.5℃為界，將產(chǎn)前發(fā)熱的200例孕婦分為高熱組92例、低熱組108例。高熱組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率，miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表達量及IL-8。hs-CRP水平均明顯高于低熱組，IκBα基因表達量低于低熱組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表 3。

2.4 產(chǎn)前發(fā)熱時間與絨毛膜炎、新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率及新生兒臍血炎癥指標的關(guān)系 以產(chǎn)前發(fā)熱持續(xù)時間24h為界，將產(chǎn)前發(fā)熱的200例孕婦分為長時間組80例、短時間組120例。長時間組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率，miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表達量及IL-8。hs-CRP水平均明顯高于短時間組（均P＜0.05），IκBα基因表達量低于短時間組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

2.5 產(chǎn)前發(fā)熱時間與發(fā)熱程度的關(guān)系 產(chǎn)前發(fā)熱長、短時間組孕婦發(fā)熱程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 5。

3 討論

絨毛膜炎的最主要臨床表現(xiàn)是母親發(fā)熱[4]，是新生兒敗血癥的危險因素之一。本研究結(jié)果顯示產(chǎn)前發(fā)熱孕婦絨毛膜炎發(fā)生率為68.0%，新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率為50.0%；進一步分析顯示，發(fā)熱程度越高，發(fā)熱持續(xù)時間越長，新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率明顯升高，分析原因可能是早產(chǎn)兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善所致，隨著母親發(fā)熱時間的延長，母嬰感染的風險明顯增高，臨床醫(yī)生應(yīng)提高警惕。

研究表明，miRNA可調(diào)節(jié)TLR2/4-NF-κB信號通路[5-6]。miR-155是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抑炎作用的新調(diào)控分子，糖皮質(zhì)激素可通過抑制NF-κB下調(diào)miR-155表達，上調(diào)細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白1表達，從而促進JAK激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，最終達到抗炎目的[7]。因此，深入研究NF-κB信號通路在產(chǎn)前發(fā)熱造成宮內(nèi)感染的激活情況、抑制細胞因子和趨化因子過表達引起的氣道炎癥，對于新生兒宮內(nèi)感染的治療具有重要作用。在靜止細胞中，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，在細胞質(zhì)中形成無活性的NF-κBIκB復(fù)合體。當細胞受到氧化。應(yīng)激等因素的刺激后，IKKs活化，IκB在IKKs復(fù)合物的作用下發(fā)生磷酸化而降解，NF-κB與IκB解離并進入細胞核，進而調(diào)控細胞因子、趨化因子等基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)前發(fā)熱孕婦分娩新生兒臍血 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表達量及IL-8、hs-CRP水平均明顯高于健康對照組，IκBα基因表達量明顯低于健康對照組；產(chǎn)前發(fā)熱孕婦絨毛膜炎及新生兒宮內(nèi)細菌發(fā)生率明顯高于健康對照組。這證實產(chǎn)前發(fā)熱可導(dǎo)致miRNA-155-NF-κB信號通路的激活，同時絨毛膜炎與宮內(nèi)細菌感染存在直接聯(lián)系。進一步作亞組分析，結(jié)果顯示產(chǎn)前發(fā)熱程度及持續(xù)時間與新生兒宮內(nèi)細菌感染的發(fā)生有關(guān)。但是本研究產(chǎn)前發(fā)熱組孕婦絨毛膜炎及新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率高于其他文獻報道[8-9]，可能與個體差異、入選偏倚因素等有關(guān)，故本研究結(jié)果僅作為該類疾病發(fā)病率的參考。

表2 產(chǎn)前發(fā)熱組與健康對照組新生兒臍血炎癥指標比較

表3 產(chǎn)前高、低熱組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率及新生兒臍血炎癥指標比較

表4 產(chǎn)前發(fā)熱長、短時間組孕婦絨毛膜炎、新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率及新生兒臍血炎癥指標比較

表5 產(chǎn)前發(fā)熱長、短時間組孕婦發(fā)熱程度比較[例（%）]

綜上所述，產(chǎn)前發(fā)熱孕婦絨毛膜炎及新生兒宮內(nèi)細菌感染發(fā)生率較高，臍血miRNA-155基因表達上調(diào)，NF-κB信號通路激活；產(chǎn)前1周體溫＞38.5℃或持續(xù)時間＞24h者表現(xiàn)更明顯。對于產(chǎn)前發(fā)熱孕婦，檢測新生兒臍血 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IκBα、IL-8 基因表達及IL-8、hs-CRP水平等，有利于預(yù)測新生兒宮內(nèi)細菌感染、盡早診斷與治療。