miRNA-224-5p靶向JAG1抑制乳腺癌細(xì)胞自噬活性的機(jī)制研究

王毅超 謝姣貴 潘印 朱杰 楊合慧 朱韜 李招云

乳腺癌是全世界婦女最常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)病率位居女性腫瘤的第2位[1]。目前我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，預(yù)計(jì)至2021年，中國(guó)將有超過(guò)220萬(wàn)例女性罹患乳腺癌[2]。目前關(guān)于乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明，且缺少可靠、準(zhǔn)確的分子標(biāo)志物用于早期診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及預(yù)后分析；因此，探討乳腺癌進(jìn)展的相關(guān)分子機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)成為乳腺癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。自噬是真核細(xì)胞生物中進(jìn)化保守地對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)一種通過(guò)溶酶體降解長(zhǎng)壽命蛋白和受損細(xì)胞器的代謝途徑[3-4]。自噬可減少缺氧誘發(fā)的腫瘤壞死，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是生物體內(nèi)普遍存在且進(jìn)化上高度保守的一類非編碼小分子RNA，可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，個(gè)體發(fā)育及新陳代謝等生理活動(dòng)[7]。研究顯示，miRNA-224-5p在腫瘤組織、外周血或細(xì)胞中的表達(dá)譜明顯不同于正常組織或細(xì)胞[8]。因此，本研究測(cè)定了乳腺癌患者血清中miRNA-224-5p的表達(dá)，并探討乳腺癌細(xì)胞中miRNA-224-5p對(duì)自噬活性的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集臺(tái)州市中心醫(yī)院2017年1月至2018年9月收治且行手術(shù)治療的40例乳腺癌女性患者（乳腺癌組）及同期性別、年齡相匹配的40例健康體檢者（健康對(duì)照組）的血液樣本。乳腺癌組患者年齡（49.5±10.6）歲；癌胚抗原水平（20.37±15.21）kU/L；CA153 水平為（33.18±10.56）μg/L；腫瘤位置：右乳 14 例，左乳 26例；手術(shù)類型：乳腺癌保乳術(shù)22例，改良乳腺癌根治術(shù)15例，腫塊切除術(shù)2例，單純?nèi)榉壳谐g(shù)1例；術(shù)后病理檢查：Luminal A型11例，Luminal B型19例，三陰性6 例，Her-2（3+）2 例，Her-2（2+）2 例；合并高血壓 5 例，糖尿病1例；均無(wú)飲酒史或吸煙史。健康對(duì)照組年齡（48.0±9.0）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，兩組對(duì)象或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 材料 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司，LC3 抗體（L7543，1∶2 000）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，SQSTM1/p62（sc-28359，1∶500）購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒購(gòu)自蘇州吉馬基因公司。

1.3 血清miRNA-224-5p表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。使用Trizol試劑盒提取血清總RNA，采用RNA 6000 Nano LabChip Kit（安捷倫）和Bioanalyzer 2100測(cè)定RNA的純度和濃度，然后置于-80℃冰箱內(nèi)備用。使用Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，配置為20μl的體系，將提取到的核糖核苷酸反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的第一鏈DNA。使用Super Real PreMIix Plus（北京天根生化科技有限公司）和ABI7300 Plus系統(tǒng)進(jìn)行熱循環(huán)完成qRT-PCR。引物序列如下：miRNA-224-5p 正義為 5′-TGCCCTAGTGACTACAAAGTCG-3′，反義為 5′-CAGTGCAGGTCCGAGGTAT-3′；U6 正義為5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′，反義為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miRNA-224-5p mimics：5′-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3′，miRNA-224-5p inhibitor：5′-CUAAACGGAACCACUAGUGACUU －GA-3′。以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫印跡試驗(yàn)。（1）取乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，以8×104/孔濃度鋪12孔板，每孔加完全培養(yǎng)基1ml；當(dāng)細(xì)胞融合度為60%左右時(shí)，換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，饑餓處理24h，使用Lipofectamine 2000及20nM miRNA-224-5p mimics（空白對(duì)照組）、miRNA-224-5p inhibitor（抑制物組）或空質(zhì)粒（空質(zhì)粒組）轉(zhuǎn)染MDAMB-231細(xì)胞。（2）轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行裂解和純化，取細(xì)胞裂解物進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白水平檢測(cè)，包括 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等。

1.5 miRNA-224-5p靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org）、MiRDB（http://mirdb.org/miRDB/）在線預(yù)測(cè) miRNA-224-5p靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miRNA-224-5p的靶基因是否為JAG1。將野生型的JAG1 3′-UTR片段或其突變體（沒(méi)有預(yù)測(cè)的miRNA-224-5p靶序列）分別構(gòu)建到pmirGLO質(zhì)粒上，將構(gòu)建的2種質(zhì)粒pmirGLO-JAG1野生型或突變型分別與miRNA-224-5p或陰性對(duì)照（空載體）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞裂解液，采用雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)熒光活力，生物熒光檢測(cè)儀分析相對(duì)值，即相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-224-5p在乳腺癌血清中的表達(dá) 乳腺癌組血清miRNA-224-5p相對(duì)表達(dá)量為188.51±59.26，明顯高于健康對(duì)照組的41.63±14.29，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這初步表明miRNA-224-5p的表達(dá)上調(diào)與乳腺癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。

2.2 MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 抑制miRNA-224-5p表達(dá)后，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞SQSTM1蛋白表達(dá)水平較空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組明顯降低，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯降低，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平較空質(zhì)粒組、空白對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1和表1。這說(shuō)明miRNA-224-5p具有抑制乳腺癌細(xì)胞自噬活性的作用。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-224-5p與攜帶JAG1野生型3′-UTR的載體共轉(zhuǎn)染后，與陰性對(duì)照組相比，相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05）；而缺失靶位點(diǎn)的突變型3′-UTR與miRNA-224-5p共轉(zhuǎn)染后，與陰性對(duì)照組相比，相對(duì)熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2和表2。這表明JAG1是miRNA-224-5p的靶基因。

圖1 3組MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表1 3組MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平

圖2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA-224-5p與JAG1結(jié)合的靶基因序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度

3 討論

乳腺癌是威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤[9]，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率持續(xù)增高[10-11]。我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率也呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，開(kāi)發(fā)新型標(biāo)志物以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌患者的早期診斷和個(gè)體化治療，是十分重要的工作。近年來(lái)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[12-13]。miRNA在各體液中穩(wěn)定表達(dá)且具有腫瘤特異性、高度穩(wěn)定性，提示其作為疾病生物標(biāo)志物的潛能[14]。miRNA-224-5p是哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一組miRNA前體，位于chrxq28，GABRE基因區(qū)，是一個(gè)已知的轉(zhuǎn)錄靜止區(qū)。已有研究提示，miRNA-224在許多腫瘤中表達(dá)異常，可調(diào)控與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的許多關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程[15-16]。在非小細(xì)胞肺癌中，miRNA-224-5p通過(guò)靶向RASSF8促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[17]；在骨肉瘤中，miRNA-224-5p參與了腫瘤的發(fā)生等[18]。目前關(guān)于miRNA-224-5p是否參與乳腺癌發(fā)生的研究較少。

本研究檢測(cè)了miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較健康對(duì)照組明顯升高。同時(shí)檢測(cè)了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等3種自噬蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示抑制miRNA-224-5p表達(dá)后，SQSTM1、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯降低，LC3Ⅱ表達(dá)明顯升高。這說(shuō)明在乳腺癌患者中miRNA-224-5p的升高伴隨著自噬活性的減弱。此外還發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，miRNA-224-5p對(duì)自噬作用無(wú)明顯的影響，這可能是miRNA-224-5p在MDA-MB-231細(xì)胞中天然高表達(dá)的原因。然而在抑制實(shí)驗(yàn)中，miRNA-224-5p水平直接影響細(xì)胞自噬水平，miRNA-224-5p可抑制細(xì)胞的自噬活性。故本研究初步表明，miRNA-224-5p可通過(guò)抑制乳腺癌自噬而參與乳腺癌的進(jìn)展。

越來(lái)越多研究表明，miRNA可通過(guò)與腫瘤相關(guān)靶蛋白的miRNA結(jié)合后，作為促癌因子或抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生過(guò)程。為了闡明miRNA-224-5p抑制自噬的分子機(jī)制，本研究鑒定了可能由miRNA-224-5p調(diào)節(jié)自噬途徑中的潛在靶標(biāo)。首先，通過(guò)生物信息學(xué)的網(wǎng)絡(luò)軟件TargetScan 7.2和MiRDB對(duì)miRNA-224-5p的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAG1有2個(gè)miRNA-224-5p潛在的結(jié)合位點(diǎn)，則推測(cè)JAG1為其靶基因。之后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因作了進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示miRNA-224-5p可互補(bǔ)結(jié)合JAG1的mRNA位點(diǎn)，即JAG1為miRNA-224-5p的靶基因。JAG1基因在染色體上定位于20p12，是5種Notch配體中的一種，屬于DSL蛋白家族，是單次跨膜蛋白，在細(xì)胞增殖分化過(guò)程中主要通過(guò)激活Notch信號(hào)通路發(fā)揮作用[19]。有研究表明，阻斷JAG1可以抑制乳腺癌細(xì)胞的繼續(xù)分裂，甚至引起細(xì)胞死亡，抑制Notch1表達(dá)后乳腺癌干細(xì)胞微球體的生成數(shù)量會(huì)下降，并且細(xì)胞的侵襲性、腫瘤的繁殖力和侵襲力均會(huì)減弱，這些預(yù)示著Notch1與乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[20-21]。因此，筆者推測(cè)miRNA-224-5p可能是靶向JAG1通過(guò)Notch信號(hào)通路發(fā)揮作用，從而參與乳腺癌的惡性行為。

綜上所述，miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中高表達(dá)，在MDA-MB-231細(xì)胞中miRNA-224-5p通過(guò)靶向JAG1抑制自噬活性。后續(xù)將從分子水平方面進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-224-5p與JAG1的直接相互作用，為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。