鋅指蛋白545對(duì)結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移侵襲的影響

潘烽平 陳一鵬 李彥 張明明

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤[1-2]。腫瘤細(xì)胞早期侵襲和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者的主要死亡原因[3]。因此，深入研究結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。鋅指蛋白545（ZNF545）是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。近期研究表明，ZNF545在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[4-6]。本課題組前期研究結(jié)果提示，ZNF545在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)異常缺失，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及患者的預(yù)后顯著相關(guān)[7]。然而，ZNF545在結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機(jī)制尚不明確。因此，筆者研究了ZNF545對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的調(diào)控以及遷移和侵襲能力的影響，并探索可能的分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株及培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、Caco2、Lovo和HCT116購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院研究所。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 先采用免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè) 4 株結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW480、Lovo、Caco2、HCT116 中ZNF545表達(dá)水平。選取內(nèi)源性ZNF545高表達(dá)的細(xì)胞用于敲低實(shí)驗(yàn)，低表達(dá)的細(xì)胞用于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)并合成特異性沉默ZNF545的siRNA（siRNA-ZNF545）及陰性對(duì)照siRNA（siRNA-control），采用Lipofectamin 2000（Invitrogen公司）將siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)源性ZNF545高表達(dá)的SW480細(xì)胞。過(guò)表達(dá)ZNF545的質(zhì)粒（pcDNA3.1-ZNF545）及對(duì)照質(zhì)粒（pcDNA3.1-control）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司，采用Lipofectamin 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)源性ZNF545低表達(dá)的HCT116細(xì)胞。

1.3 ZNF545對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞分別饑餓12h，經(jīng)消化、離心重懸，以1×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度重懸于200μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，均勻鋪于Transwell小室的上室，并在下室加入400μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；培養(yǎng)48h后，甲醇固定Transwell小室的下層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色、清水沖洗，最后用棉簽輕輕拭去上層細(xì)胞，在顯微鏡下觀察、拍照。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)除采用基質(zhì)膠（Matrigel膠）包被的Transwell小室外，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.4 EMT相關(guān)分子標(biāo)志物蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫印跡試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入適量含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的細(xì)胞裂解液（RIPA）提取細(xì)胞總蛋白，離心取上清液。采用蛋白濃度測(cè)定（BCA）法檢測(cè)蛋白濃度，加入樣本緩沖液后煮沸變性。取50μg蛋白樣品進(jìn)行上樣，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，再用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入ZNF545（1∶1 000，英國(guó) Abcam 公司）、E 鈣黏蛋白（E-cadherin）（1∶1 000，英國(guó) Abcam 公司）、磷酸化鋅指轉(zhuǎn)錄因子（slug，1∶1 000，英國(guó) Abcam 公司）和磷酸甘油醛脫氫酶（1∶100，英國(guó) Abcam 公司）抗體，于 4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗鼠二抗（1∶1 000，英國(guó) Abcam 公司），室溫孵育 2h。TBST 緩沖液洗膜后，使用化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光顯影。

1.5 ZNF545表達(dá)變化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響 采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。細(xì)胞成功爬片后，甲醛固定（室溫，30min）；滴加ZNF545一抗液，將玻片平置于濕盒內(nèi)，4℃過(guò)夜；加入異硫氰酸熒光素-兔抗鼠免疫球蛋白G抗體，室溫孵育2h；再用熒光染料（DAPI）復(fù)染，沖洗后封片，在熒光顯微鏡高倍鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF545在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) 內(nèi)源性ZNF545蛋白在SW480細(xì)胞中表達(dá)最高，在Lovo、Caco2細(xì)胞中的表達(dá)次之，在HCT116細(xì)胞中表達(dá)最低，見(jiàn)圖1。故本研究挑選了內(nèi)源性ZNF545高表達(dá)的SW480細(xì)胞用于敲低實(shí)驗(yàn)，低表達(dá)的HCT116細(xì)胞用于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 SW480、Lovo、Caco2、HCT116中 ZNF545 蛋白表達(dá)電泳圖

2.2 ZNF545對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 過(guò)表達(dá)ZNF545后，HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱，穿過(guò)小室基底膜的平均細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2a（插頁(yè)）；敲低ZNF545表達(dá)后SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，穿過(guò)小室基底膜的平均細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01），見(jiàn)圖 2b（插頁(yè)）。

圖2 ZNF545對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（a：過(guò)表達(dá)ZNF545抑制腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；b：敲低ZNF545表達(dá)后增強(qiáng)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力）

2.3 ZNF545對(duì)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的影響 過(guò)表達(dá)ZNF545明顯增加腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵抑癌基因E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子slug的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖3a。敲低ZNF545表達(dá)后抑制E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)增加slug的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖3b。

圖3 ZNF545對(duì)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的影響（a：過(guò)表達(dá)ZNF545抑制腸癌細(xì)胞中slug的表達(dá)，增加E-cadherin的表達(dá)；b：敲低ZNF545表達(dá)后增加腸癌細(xì)胞中slug的表達(dá)，抑制E-cadherin的表達(dá)）

2.4 ZNF545表達(dá)變化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組（HCT116組）及陰性對(duì)照組（NC組）比較，HCT116過(guò)表達(dá)ZNF545組（ZNF545組）E-cadherin的表達(dá)明顯增加，見(jiàn)圖4a（插頁(yè)）。與空白對(duì)照組（SW480組）及陰性對(duì)照組（si-NC組）比較，SW480敲低ZNF545組（si-ZNF545組）E-cadherin的表達(dá)明顯減少，見(jiàn)圖4b（插頁(yè)）。

圖4 ZNF545表達(dá)變化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響（a：過(guò)表達(dá)ZNF545增加E-caherin表達(dá)；b：敲低ZNF545表達(dá)后抑制E-caherin表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)）

3 討論

惡性腫瘤的EMT行為是近年來(lái)確定的、與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程[8]。通過(guò)EMT，上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為具有抗凋亡、降解細(xì)胞外基質(zhì)、極性丟失、促侵襲轉(zhuǎn)移等特性的間充質(zhì)表型細(xì)胞[9-10]。近年來(lái)，關(guān)于EMT與腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究增多，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸癌中普遍存在上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)丟失以及間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白Vimentin、β-鏈蛋白（β-catenin）、N-cadherin和E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子slug、ZEB1/ZEB2表達(dá)升高[11-12]。由于基因突變、表達(dá)丟失等原因?qū)е碌年P(guān)鍵抑癌基因功能缺失而引起上述EMT關(guān)鍵分子的表達(dá)改變，在驅(qū)動(dòng)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

ZNF545是新發(fā)現(xiàn)的KRAB型鋅指轉(zhuǎn)錄因子。有研究提示，ZNF545在人正常組織中廣泛表達(dá)；但在肝癌[13-14]、胃癌[4]、乳腺癌[15]及結(jié)直腸癌[16]組織中由于其啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化，導(dǎo)致ZNF545表達(dá)缺失。但目前尚無(wú)關(guān)于ZNF545在結(jié)直腸癌EMT和侵襲轉(zhuǎn)移中作用的相關(guān)報(bào)道。本研究首先檢測(cè)了ZNF545在各結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，然后挑選了內(nèi)源性ZNF545高表達(dá)的SW480細(xì)胞用于敲低實(shí)驗(yàn)；內(nèi)源性ZNF545低表達(dá)的HCT116細(xì)胞用于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Transwll小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZNF545對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)沉默ZNF545可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而過(guò)表達(dá)ZNF545則顯著降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默ZNF545可增加間質(zhì)標(biāo)志物slug蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)；過(guò)表達(dá)ZNF545則抑制slug的表達(dá)，同時(shí)增加E-cadherin的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，ZNF545能夠調(diào)控E-cadherin的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，結(jié)直腸癌組織中ZNF545的缺失表達(dá)，可能通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌EMT從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌組織中，ZNF545啟動(dòng)子的異常甲基化導(dǎo)致ZNF545低表達(dá)，進(jìn)而激活結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，ZNF545在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色。

綜上所述，ZNF545在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用，通過(guò)抑制EMT而降低結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，靶向調(diào)控ZNF545表達(dá)可能為結(jié)直腸癌的防治提供新的方向。