ATRP接枝殼聚糖分子及其對(duì)阿苯達(dá)唑載藥性能研究

趙磊，趙聰思，任雷強(qiáng)，王明亮，唐二軍，劉少杰

(河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

包蟲病是人畜共患寄生蟲病，嚴(yán)重危害人類健康和影響畜牧業(yè)發(fā)展[1]，常用的藥物阿苯達(dá)唑[2]治療效果較好，但其細(xì)胞毒性大、生物利用度差，選用藥物輔料可使藥物緩控釋放，提高苯并咪唑類藥物生物利用度。纖維素[3]和殼聚糖[4]是常用的藥用輔料，在其分子骨架接枝功能性分子刷，制備環(huán)境敏感型藥用輔料[5-10]，在藥物負(fù)載及藥物緩釋方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

本文在離子液體[Amim]Cl中，采用ATRP技術(shù)在殼聚糖上接枝分子量分布窄、分子量分布均勻的NIPA分子刷，制成溫敏性CS-g-NIPA共聚物，用透析法包載模型藥物阿苯達(dá)唑，并對(duì)其體外釋藥機(jī)制進(jìn)行研究，以期使阿苯達(dá)唑作用時(shí)間持續(xù)而平穩(wěn)，增加藥物吸收率，提高藥效。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

殼聚糖 (CS)、溴化亞銅(CuBr)、乙二胺、三乙烯四胺、N，N-2-甲基-1，3-丙二胺、四氫呋喃(THF)、阿苯達(dá)唑均為分析純；2-溴代異丁酰溴(BiB)、N-異丙基丙烯酰胺、N，N，N＇，N″，N″-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)均為優(yōu)級(jí)純。

FTS-13型傅里葉紅外光譜儀；MSL500型核磁共振光譜儀；S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡；100CX-Ⅱ型透射電子顯微鏡；Bruker D8型X射線衍射儀；UV2550紫外分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CS-g-NIPA聚合物的合成 稱取一定配比的[Amim]Cl 和CS于三口燒瓶，將其固定在油浴鍋內(nèi)進(jìn)行加熱攪拌反應(yīng)，反應(yīng)溫度維持在80 ℃，待CS溶解后，在冰水浴的條件下，將甲苯和2-溴代異丁酰溴的混合液采用恒壓滴定管慢滴于上述三口燒瓶?jī)?nèi)，室溫條件下反應(yīng)24 h后，將三口燒瓶?jī)?nèi)的反應(yīng)物和產(chǎn)物倒入盛有大量蒸餾水的燒杯內(nèi)，析出大量白色沉淀物質(zhì)，通過(guò)抽濾、洗滌、冷凍干燥等步驟即得到大分子引發(fā)劑CS-g-BiB[11]；取一定量的CS-g-BiB、[Amim]Cl于三口燒瓶中，一定溫度下，攪拌至CS溶解。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入一定配比的CuBr、1，3-丙二胺、 NIPA，在一定溫度下反應(yīng)12 h。經(jīng)過(guò)洗滌，用透析袋透析、冷凍干燥得到殼聚糖接枝共聚物CS-g-NIPA。合成路線見(jiàn)下式。

1.2.2 膠束的制備 量取一定量的DMF、DMSO于三口燒瓶中，加入一定質(zhì)量比的模型藥物阿苯達(dá)唑和CS-g-NIPA，超聲30 min，在室溫下進(jìn)行攪拌，24 h后加入2 mL蒸餾水，誘導(dǎo)聚合物形成載藥膠束。之后將中間體放于透析袋(截留分子量為3 500)中每6 h換1次水，透析48 h，冷凍干燥后可得到載藥膠束；在不放藥物的前提下，進(jìn)行上述操作即可獲得空白膠束。

1.3 藥物釋放實(shí)驗(yàn)

1.3.1 藥物釋放實(shí)驗(yàn) 在無(wú)水乙醇和冰醋酸的緩沖溶液中放10 mg載藥膠束進(jìn)行溶解，將溶液移動(dòng)到透析袋(截留分子量為3 500)并封密，置于90 mL相應(yīng)外界緩沖溶液中，并在水浴鍋中進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。分別在10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46 ℃取10 mL外界釋放液，同時(shí)加入10 mL的新鮮緩沖溶液。在相應(yīng)的波長(zhǎng)下，檢測(cè)緩沖液中的藥物含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和體外藥物釋放率的計(jì)算 將一定量的阿苯達(dá)唑溶于緩沖液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)出阿苯達(dá)唑的最大吸收波長(zhǎng)為240 nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.091 47X-0.217 4 (R2=0.999 43)；取載藥膠束粉末10 mg放入到緩沖液中，在波長(zhǎng)為240 nm的前提下，測(cè)阿苯達(dá)唑的吸光度，可得出聚合物膠束內(nèi)的藥物含量。載藥膠束在不同外界環(huán)境下的累積藥物釋放量(%)用下式[12]計(jì)算：

式中W0——10 mg載藥膠束中含有的藥物質(zhì)量，mg；

Cn——檢測(cè)時(shí)間內(nèi)第n次測(cè)量時(shí)釋放液中藥物的濃度，mg/L；

Cn-1——第n-1次測(cè)量時(shí)釋放液中藥物的濃度，mg/L；

ΣCn-1——前n-1次測(cè)量出的藥物濃度之和，mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 CS-g-NIPA接枝聚合物的紅外表征

分別對(duì)CS(曲線c)、CS-g-BiB(曲線b)、CS-g-NIPA(曲線a)進(jìn)行紅外表征分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 CS、CS-g-BiB和CS-g-NIPA 聚合物紅外表征

2.2 CS-g-NIPA接枝聚合物掃描電鏡表征

利用SEM對(duì)CS和CS-g-NIPA表面形貌進(jìn)行測(cè)試，觀察表面形態(tài)變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 CS 和 CS-g-NIPA膠束的投射電鏡圖

由圖2可知，CS(圖a)的表面密實(shí)且平滑，而接枝到殼聚糖上的NIPA分子刷，使得接枝共聚物(圖b)的表面粗糙，凹凸不平。這表明利用ATRP法制備了CS-g-NIPA，并且改變了殼聚糖的表面形態(tài)，能夠?yàn)槠湟院蟮膽?yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

2.3 CS-g-NIPA的GPC測(cè)試

利用凝膠滲透色譜測(cè)定側(cè)鏈NIPA的分子量和分子量分布(Mw/Mn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 CS-g-NIPA凝膠滲透色譜圖

由圖3可知，側(cè)鏈N-異丙基丙烯酰胺呈單峰分布，其分子量(Mn)為276 451，分子量分布(Mw/Mn)為1.27，此結(jié)果表明利用ATRP法合成的聚合物CS-g-NIPA的側(cè)鏈具有較大的數(shù)均分子量，較窄的分子量分布，反應(yīng)呈現(xiàn)出良好的可控性，有利于聚合物CS-g-NIPA自組裝形成形狀規(guī)則的膠束。

2.4 載藥前后的紅外光譜分析

對(duì)CS-g-NIPA、阿苯達(dá)唑載藥膠束、阿苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA的混合物進(jìn)行紅外檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 CS-g-NIPA空白膠束(a)、阿苯達(dá)唑(b)、阿苯達(dá)唑載藥膠束(c)和阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA混合物空白膠束(d)紅外表征

由圖4可知，在曲線b與曲線d中3 325 cm-1處出現(xiàn) —OH的紅外特征峰；在曲線a中1 650 cm-1處出現(xiàn)羰基的吸收峰，1 530 cm-1處出現(xiàn)了N—H及C—N的吸收峰；在曲線b中1 380 cm-1處出現(xiàn)了阿苯達(dá)唑的紅外特征峰。曲線a、曲線b和曲線d比較可知，曲線d的特征峰只是曲線a與曲線b的特征峰的重疊相加，曲線d的特征峰還是以曲線b的特征峰為主，說(shuō)明物理混合紅外光譜主要表現(xiàn)為阿苯達(dá)唑的紅外光譜特征；將曲線a、曲線b和曲線c的紅外圖譜對(duì)照發(fā)現(xiàn)，曲線c的特征峰與曲線a的特征峰相近，并且曲線b的特征峰與曲線c的特征峰對(duì)比發(fā)現(xiàn)，曲線c的特征峰明顯減弱，這可能是膠束已把阿苯達(dá)唑包裹，其分子振動(dòng)受到約束，在對(duì)應(yīng)的紅外特征峰處峰形變寬或不見(jiàn)[13]。包裹有阿苯達(dá)唑的聚合物膠束沒(méi)有出現(xiàn)新的特征峰，表明包覆過(guò)程只是一個(gè)物理過(guò)程，沒(méi)有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；由紅外光譜結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)合成了阿苯達(dá)唑載藥膠束。

2.5 聚合物膠束形態(tài)表征

通過(guò)ATRP法在疏水性的殼聚糖表面接枝上了親水性的溫敏性基團(tuán)，聚合物可自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的膠束，因此利用透射電鏡對(duì)CS-g-NIPA空白膠束、包載阿苯達(dá)唑的載藥膠束形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 空白膠束和CS-g-NIPA載藥膠束的電鏡圖

由圖5a可知，CS-g-NIPA的自組裝膠束呈現(xiàn)出規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，形態(tài)穩(wěn)定，這可能是因?yàn)槟z束殼層的NIPA分子內(nèi)有親水性的酰胺基和疏水性的異丙基，殼層向溶液中的溶解趨勢(shì)較小，呈現(xiàn)出規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)；與圖5a相比較，圖5b中 CS-g-NIPA包載有阿苯達(dá)唑的膠束粒徑有所增大，并且載藥后膠束無(wú)明顯交聯(lián)現(xiàn)象。膠束具有明顯的內(nèi)核-外殼結(jié)構(gòu)，分散性較好，形態(tài)較穩(wěn)定。這表明了聚合物CS-g-NIPA的膠束對(duì)阿苯達(dá)唑具有良好的包覆性能。

2.6 聚合物膠束對(duì)藥物阿苯達(dá)唑的載藥性分析及體外釋放研究

探究阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA的質(zhì)量比對(duì)載藥率和包封率的影響。當(dāng)固定CS-g-NIPA的質(zhì)量為40 mg，加入藥物阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA的質(zhì)量比為1∶2、1∶4與1∶8時(shí)，對(duì)載藥膠束的載藥率與包封率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA的質(zhì)量比對(duì)膠束載藥率和包封率的影響

由表1可知，隨著阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA質(zhì)量比的增加，載藥后膠束的粒徑和載藥率增加，包封率下降。當(dāng)阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA的質(zhì)量比由1∶2增加到1∶1時(shí)，阿苯達(dá)唑載藥膠束的載藥率由50.89%增長(zhǎng)到53.45%，而其包封率由51.77%下降到32.13%。對(duì)比質(zhì)量比為1∶8與1∶4時(shí)載藥膠束，其載藥率增長(zhǎng)的并不明顯，但是包封率明顯下降。說(shuō)明阿苯達(dá)唑與CS-g-NIPA的質(zhì)量比為1∶2時(shí)，得到的阿苯達(dá)唑載藥膠束的載藥效率的理論值最高。

對(duì)阿苯達(dá)唑與膠束CS-g-NIPA的質(zhì)量比為 1∶2，1∶4與1∶8的載藥膠束做體外藥物阿苯達(dá)唑的釋放實(shí)驗(yàn)，利用公式Y(jié)=0.091 97X-0.217 4可以計(jì)算出在不同溫度下載藥膠束對(duì)藥物阿苯達(dá)唑的釋放情況，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同質(zhì)量比的載藥膠束的藥物釋放曲線

由圖6可知，藥物阿苯達(dá)唑的累積釋藥量隨溫度的增加一直在增大，載藥膠束的累積釋藥量在31 ℃ 時(shí)有一個(gè)明顯的上升過(guò)程，但是在37 ℃以后藥物的累積釋藥量變化并不明顯，并且體外累積釋藥量的曲線有趨于平緩的趨勢(shì)，說(shuō)明載藥膠束在31～37 ℃之間具有明顯的溫敏性。對(duì)比阿苯達(dá)唑與載藥膠束質(zhì)量比為1∶2，1∶4和1∶8時(shí)的累積釋藥量曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量比為1∶2時(shí)，體外累積釋藥量最大，達(dá)到了86.47%，理論值與實(shí)際值達(dá)到一致。

將阿苯達(dá)唑與載藥膠束質(zhì)量比為1∶2的載藥膠束在不同溫度下進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)，以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，藥物累計(jì)釋放量作為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同溫度的載藥膠束的藥物釋放曲線

由圖7可知，在30 ℃時(shí)，溫度過(guò)低藥物的釋放受溫度影響較小，藥物的釋放行為相對(duì)最慢，并且累計(jì)釋放量在20 h后僅為36.84%；在溫度為35 ℃ 時(shí)藥物釋放曲線較為穩(wěn)定，釋藥時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)30 h，并且釋放量高達(dá)77.37%；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，藥物的累積釋放量在短時(shí)間內(nèi)劇增，5 h已經(jīng)高達(dá)68.47%，對(duì)藥物緩釋最快。不同比例載藥膠束的藥物釋放曲線表明，載藥膠束在31～37 ℃之間具有明顯的溫敏性，當(dāng)藥物阿苯達(dá)唑與膠束CS-g-NIPA的質(zhì)量比為1∶2時(shí)，體外累積釋藥量達(dá)到最高；由不同溫度的載藥膠束的藥物釋放曲線進(jìn)一步表明，阿苯達(dá)唑與載藥膠束質(zhì)量比為1∶2的殼聚糖載藥膠束在 35 ℃時(shí)的累積釋放時(shí)間可高達(dá)30 h，累積釋藥量高達(dá)77.37%，并且藥物釋放曲線較為平緩，對(duì)阿苯達(dá)唑具有很好的控釋作用，在包蟲病的治療上有較好的應(yīng)用前景。

載藥膠束在不同溫度條件下對(duì)模型藥物的釋放結(jié)果示意圖見(jiàn)圖8。

圖8 低溫與高溫條件下藥物釋放機(jī)制

當(dāng)溫度升高時(shí)，H2O分子與 —CO—NH— 基團(tuán)之間的氫鍵作用被削弱，NIPA與水的相容性減弱，構(gòu)象從伸展的鏈變?yōu)榫砬湛s的鏈。NIPA支鏈的這種溶脹/收縮熱可逆性，使CS-g-NIPA微球?qū)λ獾乃幬锂a(chǎn)生熱響應(yīng)性釋放控制。由圖8可知，用CS-g-NIPA膠束包載藥物阿苯達(dá)唑，在LCST以下，接枝鏈在水中舒展開(kāi)來(lái)，彼此交叉覆蓋，阻塞了膠束的孔洞，被包封的藥物擴(kuò)散受阻，處于“關(guān)”狀態(tài)；溫度在LCST以上時(shí)，接枝鏈自身收縮，孔洞顯現(xiàn)出來(lái)，使藥物順利擴(kuò)散到水中，處于“開(kāi)”狀態(tài)[14]。

3 結(jié)論

采用ATRP技術(shù)制備的溫敏性聚合物CS-g-NIPA分子量分布窄且均勻，當(dāng)其與阿苯達(dá)唑的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，阿苯達(dá)唑載藥膠束在31～37 ℃之間具有良好的溫敏性和釋藥性，這也為治療包蟲病的方面上奠定理論基礎(chǔ)。