不同品種茶葉指紋圖譜的建立及其相似度評(píng)價(jià)

張玲玲,孔 娟,李小芬,馮 華,王祥培,吳紅梅,*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州貴陽(yáng) 550025;2.遵義食品藥品檢驗(yàn)所,貴州遵義 563002)

茶是世界三大非酒精飲料之一,其地位僅次于水[1]。茶是山茶科植物茶(CamelliasinensisO.ktunze)的葉子經(jīng)過(guò)加工制成,主要生長(zhǎng)在亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]。研究表明茶葉具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、降脂減肥等功效[3-11]。茶葉中主要含有茶多酚、茶多糖、茶氨酸、咖啡因等化合物[12-15],其中茶多酚具有抗增殖和抗炎癥的作用,能一定程度預(yù)防癌癥、心血管、糖尿病等疾病的發(fā)生[16-19]。此外,茶葉還具有獨(dú)特的香氣與味道被廣泛使用在食品、飲料和化妝品等領(lǐng)域[20-22]。茶葉的種類(lèi)繁多,根據(jù)制作工藝的不同分為未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及發(fā)酵茶等[23],如碧螺春、西湖龍井屬于未發(fā)酵茶,大紅袍與鐵觀音屬于半發(fā)酵茶,遵義紅茶屬于全發(fā)酵茶[24-25]。又根據(jù)茶葉的外形、色澤、香氣、凈度等因素影響可劃分為特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)等多種等級(jí)[26-27]。目前,市場(chǎng)上審評(píng)茶葉的品種及品質(zhì)優(yōu)劣仍以感官為主,理化檢驗(yàn)為輔,受主觀因素影響較大,導(dǎo)致市場(chǎng)上茶葉質(zhì)量參差不齊,缺乏可量化的標(biāo)準(zhǔn)[28]。

指紋圖譜是指在固定的實(shí)驗(yàn)條件下將待測(cè)物經(jīng)適當(dāng)處理后得到的能標(biāo)識(shí)其化學(xué)特征的譜圖[29],指紋圖譜具有整體性、可量化的特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制、食品評(píng)價(jià)、種子檢測(cè)和鑒定等領(lǐng)域[30-34]。其中高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜可用于分析茶葉中的非揮發(fā)性成分[35-36],但應(yīng)用多品種、多廠家、多等級(jí)茶葉的研究較少。本文運(yùn)用高效液相色譜研究不同品種茶葉的指紋圖譜并評(píng)價(jià)不同品種茶葉及同品種不同等級(jí)、不同廠家茶葉的差異,以期為茶葉的質(zhì)量控制和科學(xué)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10個(gè)茶葉品種共33批茶葉樣品(品種有湄潭翠芽、都勻毛尖、遵義紅茶、鐵觀音、綠寶石、碧螺春、西湖龍井、鳳崗鋅硒茶、大紅袍、天柱茶葉) 樣品來(lái)源如表1所示;甲醇、乙腈 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;磷酸 重慶川東有限公司;沒(méi)食子酸(GC)、表兒茶素(EC) 中國(guó)藥品生物制品鑒定所;表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG) 純度≥98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

表1 茶葉樣品來(lái)源

Agilent 1260高效液相色譜儀(PDA檢測(cè)器) 安捷倫科技有限公司;AG135電子天平、AB265-S電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-100E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;800Y型多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱(chēng)取沒(méi)食子酸10.76 mg、表兒茶素10.34 mg、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯10.00 mg、表兒茶素沒(méi)食子酸酯10.26 mg分別用75%甲醇水溶解并配制成沒(méi)食子酸0.2152 mg/mL、表兒茶素0.2068 mg/mL、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯0.8000 mg/mL、表兒茶素沒(méi)食子酸酯0.5130 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.2 mL定容到1 mL,搖勻即可。

1.2.2 供試品的制備 稱(chēng)取茶樣粉末(過(guò)65目篩)0.5 g,置于100 mL圓底燒瓶中,加入75%甲醇水50 mL,加熱回流提取2次,每次30 min,合并濾液并定容到100 mL,搖勻過(guò)0.22 μm微孔濾膜,備用。

1.2.3 色譜條件 流動(dòng)相A為0.2%的磷酸水,流動(dòng)相B為乙腈;色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。分析時(shí)間57 min。梯度洗脫方法:0～15 min,5%～10% B;15～32 min,10%～12% B;32～37 min,12%～18% B;37～44 min,18%～20% B;44～49 min,20%～22% B;49～57 min,22%～30% B。系統(tǒng)平衡色譜柱時(shí)間為10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版進(jìn)行相似度分析并建立不同品種茶葉指紋圖譜,使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 儀器精密度實(shí)驗(yàn) 取產(chǎn)自永興茶葉生產(chǎn)基地的特級(jí)湄潭翠芽,按“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備,在“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,進(jìn)樣量為10 μL,考察儀器的精密度。結(jié)果表明,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD均小于3%,說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取產(chǎn)自永興茶葉生產(chǎn)基地的特級(jí)湄潭翠芽,按“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備提取液,按“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10 μL,考察茶葉提取液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD均小于3%,說(shuō)明茶葉提取液在24 h穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取產(chǎn)自永興茶葉生產(chǎn)基地的特級(jí)湄潭翠芽,按“1.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備分析樣品,按“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10 μL,考察實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。結(jié)果表明,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%,說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

稱(chēng)取33批茶葉樣品各0.5 g,精密稱(chēng)量,按“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品,按“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),提取不同茶葉樣品在280 nm處的色譜圖,導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),進(jìn)行色譜峰匹配,應(yīng)用中位數(shù)法,時(shí)間窗寬度為 0.3,生成33批茶葉樣品的HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜,見(jiàn)圖1～圖2,并標(biāo)定5個(gè)共有峰,確認(rèn)了其中沒(méi)食子酸(1號(hào)峰)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(10號(hào)峰)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(14號(hào)峰),見(jiàn)圖3。按照上述方法,建立同一品種不同等級(jí)、廠家茶葉指紋圖譜,即湄潭翠芽不同廠家、等級(jí)的HPLC指紋圖譜(圖4)、鳳崗鋅硒茶不同廠家、等級(jí)的HPLC指紋圖譜(圖5)、鐵觀音不同廠家、等級(jí)的HPLC指紋圖譜(圖6)、遵義紅茶不同等級(jí)的HPLC指紋圖譜(圖7)、都勻毛尖不同等級(jí)的HPLC指紋圖譜(圖8)、綠寶石不同等級(jí)的HPLC指紋圖譜(圖9),選擇含量相對(duì)較高、性質(zhì)較穩(wěn)定、保留時(shí)間居中、峰形好且有較好的分離度及在各樣品中均存在的7號(hào)峰為參照峰S,其保留時(shí)間和峰面積為 1,并計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,見(jiàn)表2～表3。

表2 不同茶葉樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(min)

續(xù)表

圖8 都勻毛尖不同等級(jí)的HPLC指紋圖譜

表3 不同茶葉樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積(mAU)

續(xù)表

圖1 33批茶葉樣品的HPLC指紋圖譜

圖9 綠寶石不同等級(jí)的HPLC指紋圖譜

圖2 33批茶葉對(duì)照指紋圖譜

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

圖4 湄潭翠芽不同廠家、等級(jí)的HPLC指紋圖譜

圖5 鳳崗鋅硒茶不同廠家、等級(jí)的HPLC指紋圖譜

圖6 鐵觀音不同廠家、等級(jí)的HPLC指紋圖譜

圖7 遵義紅茶不同等級(jí)的HPLC指紋圖譜

2.3 相似度評(píng)價(jià)

2.3.1 不同品種茶葉的相似度評(píng)價(jià) 將33批茶葉樣品的HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》軟件中,應(yīng)用中位數(shù)法,時(shí)間窗寬度為0.3,生成對(duì)照指紋圖譜并對(duì)其進(jìn)行編號(hào),測(cè)得樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度,不同品種茶葉相似度在0.681～0.999,見(jiàn)表4。

表4 33批茶葉樣品的相似度

2.3.2 各品種不同等級(jí)、不同廠家茶葉相似度評(píng)價(jià) 湄潭翠芽不同等級(jí)、不同廠家的相似度在0.968～0.998;鳳崗鋅硒茶不同等級(jí)、不同廠家的相似度在0.987～1.000;鐵觀音不同等級(jí)、不同廠家的相似度在0.974～0.996;不同等級(jí)的遵義紅茶相似度在0.989～1.000;不同等級(jí)都勻毛尖相似度在0.989～1.000;不同等級(jí)綠寶石相似度在0.996～1.000。結(jié)果顯示同品種不同等級(jí)、不同廠家茶葉相似度較高,說(shuō)明同一品種不同等級(jí)及不同廠家茶葉的品質(zhì)較為接近,茶葉品質(zhì)差異較小,其茶葉品質(zhì)的差異主要取決于原料及制作工藝等因素的影響,結(jié)果見(jiàn)表5～表10。

表5 湄潭翠芽不同等級(jí)、不同廠家的相似度

表6 鳳崗鋅硒茶不同等級(jí)、不同廠家的相似度

表7 鐵觀音不同等級(jí)、不同廠家的相似度

表8 遵義紅茶不同等級(jí)的相似度

表9 都勻毛尖不同等級(jí)的相似度

表10 綠寶石不同等級(jí)的相似度

2.4 共有峰的確定

2.4.1 不同茶葉樣品共有峰的確定 取各品種不同廠家、不同等級(jí)茶葉共33批茶樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并測(cè)定其結(jié)果,綜合33批樣品的色譜圖(圖1),有5個(gè)共有峰,分別為1、2、7、10、14號(hào)峰,其中確認(rèn)1號(hào)峰為沒(méi)食子酸,10號(hào)峰為表兒茶素沒(méi)食子酸酯,14號(hào)峰為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯,且各批茶葉樣品的5個(gè)共有峰總面積占總峰面積的80%以上。此外,還確認(rèn)9號(hào)峰為表兒茶素。西湖龍井有15個(gè)共有峰,湄潭翠芽有14個(gè)共有峰,天柱茶葉有14個(gè)共有峰,鳳崗鋅硒茶有13個(gè)共有峰,都勻毛尖有13個(gè)共有峰,綠寶石有12個(gè)共有峰,碧螺春有12個(gè)共有峰,大紅袍有11個(gè)共有峰,遵義紅茶有8個(gè)共有峰、鐵觀音有8個(gè)共有峰,各品種共有峰個(gè)數(shù)差異較大,說(shuō)明不同品種茶葉成分差異大。

2.4.2 不同品種茶葉間共有峰的比較 從共有峰上發(fā)現(xiàn),西湖龍井、天柱茶葉及湄潭翠芽之間比較有13個(gè)共有峰,共有峰數(shù)目較多,提示這三種茶葉成分可能更為接近。都勻毛尖、鳳崗鋅硒茶、綠寶石及碧螺春之間比較有11個(gè)共有峰,西湖龍井、天柱茶葉、湄潭翠芽與都勻毛尖、鳳崗鋅硒茶、綠寶石及碧螺春比較有10個(gè)共有峰,大紅袍及鐵觀音之間比較有8個(gè)共有峰,大紅袍、鐵觀音與西湖龍井、天柱茶葉、鳳崗鋅硒茶、湄潭翠芽、都勻毛尖、綠寶石及碧螺春之間有6個(gè)共有峰,遵義紅茶與西湖龍井、天柱茶葉、鳳崗鋅硒茶、湄潭翠芽、都勻毛尖、綠寶石及碧螺春之間有7個(gè)共有峰,遵義紅茶與大紅袍及鐵觀音比較有5個(gè)共有峰,其共有峰數(shù)目減少,提示以上幾種茶葉相似度雖高,但在茶葉成分上有差異。

2.5 指紋圖譜聚類(lèi)分析

采用SPSS軟件對(duì)33個(gè)茶樣品共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖10),在標(biāo)度為11時(shí),可分為3類(lèi),即湄潭翠芽(S1～S9)、鳳崗鋅硒茶(S10～S15)、都勻毛尖(S16～S18)、碧螺春(S27)、西湖龍井(S29)、天柱茶葉(S30)及綠寶石(S31～S33)聚為一類(lèi),大紅袍(S28)與鐵觀音茶(S22～S26)聚為一類(lèi),遵義紅茶(S19～S21)聚為一類(lèi),茶葉根據(jù)制作工藝的不同可分為未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及全發(fā)酵茶等[23],湄潭翠芽、鳳崗鋅硒茶、都勻毛尖、碧螺春、西湖龍井、天柱茶葉屬于未發(fā)酵茶,大紅袍與鐵觀音屬于半發(fā)酵茶,遵義紅茶屬于全發(fā)酵茶[24-25]。因此,通過(guò)對(duì)33批茶樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析,可以區(qū)分發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及未發(fā)酵茶三種不同制作工藝的茶葉。

圖10 33批次茶葉樣品指紋圖譜聚類(lèi)分析

3 討論與結(jié)論

本研究采用 HPLC 指紋圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)對(duì)不同品種茶葉、不同廠家茶葉、不同等級(jí)茶葉進(jìn)行分析,除遵義紅茶外,其余茶葉中均含有表兒茶素,有5個(gè)共有峰,其中確認(rèn)了沒(méi)食子酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯3個(gè)共有峰,且不同品種茶葉的相似度為0.681～0.999,不同品種茶葉相似度較低、共有峰個(gè)數(shù)差異大,提示不同品種茶葉間可能有較大差異,其中,遵義紅茶的相似度最低為0.681。紅茶屬于全發(fā)酵茶,根據(jù)制作工藝的不同可將茶葉分為未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及全發(fā)酵茶等[23]。不同制作工藝會(huì)使其化學(xué)成分遭到破壞,且茶多酚會(huì)不同程度被降解,如半發(fā)酵茶會(huì)破壞茶葉中的葉綠素,其茶多酚含量較未發(fā)酵茶葉中的低[37-38]。遵義紅茶相似度低可能與其是全發(fā)酵茶有關(guān)。此外,對(duì)于同品種、不同等級(jí)、不同廠家的茶葉進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)各個(gè)品種茶葉相似度在0.968～1.000,表明同一品種不同等級(jí)及不同廠家茶葉的品質(zhì)較為接近,茶葉品質(zhì)差異較小,其茶葉品質(zhì)的差異主要取決于原料及發(fā)酵工藝等因素的影響。

對(duì)于33茶葉樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果表明,在標(biāo)度為11時(shí)即分為3類(lèi),湄潭翠芽、鳳崗鋅硒茶、都勻毛尖、碧螺春、西湖龍井、天柱茶葉及綠寶石為一類(lèi),大紅袍與鐵觀音茶為一類(lèi),遵義紅茶為一類(lèi),其聚類(lèi)結(jié)果與相似度分析結(jié)果基本一致。因此,通過(guò)對(duì)33批茶樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析,可以區(qū)分發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及未發(fā)酵茶三種不同發(fā)酵工藝的茶葉。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立不同品種茶葉HPLC指紋圖譜并結(jié)合聚類(lèi)分析方法,可區(qū)分發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及未發(fā)酵茶三種不同制作工藝的茶葉,并評(píng)價(jià)不同品種茶葉及同品種不同等級(jí)、不同廠家茶葉品質(zhì)的差異,可為茶葉的質(zhì)量控制和科學(xué)應(yīng)用提供參考依據(jù)。