基于DNA檢測(cè)的肉制品鑒偽技術(shù)研究進(jìn)展

龐博文,王勤志,王俊濤,夏 寧,滕建文,韋保耀,黃 麗

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

肉制品摻假和偽造現(xiàn)象主要有三大類(lèi):一是在高值肉類(lèi)中摻入低值肉,二是以雜交品種肉冒充純種肉,三是使用偽造或錯(cuò)誤的食品標(biāo)簽。國(guó)際上關(guān)于肉類(lèi)產(chǎn)品標(biāo)簽錯(cuò)誤的事件主要是肉制品成分標(biāo)識(shí)不清晰、不準(zhǔn)確[1-4]。意大利的加工肉類(lèi)產(chǎn)品中標(biāo)簽錯(cuò)誤率高達(dá)57%[1],魚(yú)片的標(biāo)簽錯(cuò)誤率達(dá)42.8%[2]。在美國(guó)銷(xiāo)售的肉類(lèi)產(chǎn)品中標(biāo)簽錯(cuò)誤率達(dá)35%[3],水產(chǎn)肉類(lèi)中的蝦和對(duì)蝦達(dá)24.4%[4]。這些摻假偽造行為多與經(jīng)濟(jì)效益、食品原料和宗教信仰等關(guān)系緊密,且往往不易被消費(fèi)者察覺(jué)。此外,某些潛在的未申報(bào)物種如不同種類(lèi)的軟體動(dòng)物等也可能作為過(guò)敏源被摻入摻假肉制品中,這對(duì)過(guò)敏消費(fèi)者構(gòu)成嚴(yán)重的健康威脅,故有必要采取科學(xué)有效的鑒偽方法。

目前,應(yīng)用于肉制品鑒偽領(lǐng)域的檢驗(yàn)技術(shù)種類(lèi)繁多,如早期開(kāi)發(fā)的感觀分析、電泳分析、液相色譜等,也包括逐步發(fā)展起來(lái)的與PCR相關(guān)的技術(shù)[5],如qPCR、ddPCR、Multiplex PCR和ISSR-PCR[6]等,還包括ELISA、Bar-HRM、LAMP、RFLP、Microsatellites等。其中qPCR多用于物種鑒定,RFLP多用于肉類(lèi)品種鑒別,Microsatellites、NGS多用于同時(shí)鑒定食品中的動(dòng)植物種類(lèi),HRM多用于傳統(tǒng)肉制品鑒偽,DNA barcoding用于肉制品中摻入植物源物質(zhì)的鑒別,ddPCR用于肉制品摻假檢驗(yàn),LAMP、Multiplex PCR多用于PDO(受保護(hù)的原產(chǎn)地名稱(chēng))認(rèn)證,Bar-HRM則多用于肉類(lèi)物種發(fā)源地認(rèn)證。但有些分析技術(shù)因其局限性而無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)當(dāng)今社會(huì)高端造假手段的鑒別[7],故需要對(duì)有發(fā)展?jié)摿Φ膹?qiáng)勢(shì)技術(shù)進(jìn)行更深入的研究。

本文綜述近五年(2014～2019)報(bào)道的基于DNA的肉制品鑒偽方法[8],包括食品認(rèn)證領(lǐng)域內(nèi)的新興鑒偽技術(shù),也包括沿用至今的經(jīng)典鑒偽技術(shù),以期為肉制品鑒偽的相關(guān)研究提供參考。

1 肉制品鑒偽PCR技術(shù)

1.1 PCR鑒定的原理和優(yōu)缺點(diǎn)

PCR是一種生物體外的聚合鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng),可以在幾小時(shí)內(nèi)通過(guò)引物和酶對(duì)特定的核酸序列進(jìn)行數(shù)百萬(wàn)次擴(kuò)增。常規(guī)PCR方法的原理是經(jīng)PCR擴(kuò)增特異性片段后,利用瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳后的結(jié)果,根據(jù)陰陽(yáng)性或片段大小以鑒定區(qū)分不同物種。PCR因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快且成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為肉類(lèi)摻假檢驗(yàn)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)方法,且得到了廣泛的應(yīng)用。但普通的PCR技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本昂貴且技術(shù)要求高,不能滿(mǎn)足肉類(lèi)市場(chǎng)的管理需求。因而,許多與PCR相關(guān)的改良技術(shù)被提出。

1.2 PCR相關(guān)技術(shù)

1.2.1 多重PCR 多重PCR方法是將多個(gè)引物對(duì)用在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中,利用一個(gè)模板反應(yīng)可以得到多個(gè)擴(kuò)增片段,在一次PCR反應(yīng)中使用基于細(xì)胞核DNA和線(xiàn)粒體DNA的多個(gè)引物對(duì),可以精確檢測(cè)多種物種成分。故其被廣泛應(yīng)用于食品中存在的物種的檢測(cè)和分化[9]。

多重PCR分析可通過(guò)使用物種特異性引物同時(shí)鑒定多個(gè)物種,在進(jìn)行靈敏的定性測(cè)定時(shí),通常選擇具有高細(xì)胞拷貝數(shù)的線(xiàn)粒體DNA。盡管PCR測(cè)定的可用性在很大程度上取決于目標(biāo)DNA的質(zhì)量和數(shù)量,但通過(guò)使用熱循環(huán)儀對(duì)目標(biāo)DNA分子的指數(shù)擴(kuò)增,可產(chǎn)生高達(dá)數(shù)百萬(wàn)的擴(kuò)增量,并可檢測(cè)到復(fù)雜基質(zhì)中濃度極低的目標(biāo)物。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)線(xiàn)粒體區(qū)域的多重PCR測(cè)定,以同時(shí)檢測(cè)肉中的不同動(dòng)物物種,檢測(cè)靈敏度低至1 pg DNA[10-13]。此外,在摻假的肉丸中可識(shí)別出低至0.1%的狗、大鼠和兔肉[14-15]。然而,由于每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)在同一個(gè)體內(nèi)的物種、個(gè)體甚至組織之間發(fā)生變化,使得線(xiàn)粒體基因不適合量化。因此,在需要量化以確保食品真實(shí)性的情況下,選用核基因更為合適[16]。

多重PCR技術(shù)既繼承了常規(guī)PCR的優(yōu)點(diǎn),又可以在同一次反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)物種,大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。但多重PCR技術(shù)也存在不足之處,其檢測(cè)重?cái)?shù)越多,效率一致性往往越低。針對(duì)MPCR擴(kuò)增效率一致性的問(wèn)題,傳統(tǒng)單管多靶標(biāo)擴(kuò)增的方式通過(guò)不斷優(yōu)化反應(yīng)體系中緩沖液、酶、引物、探針等的用量,確保每一重的擴(kuò)增效率保持一致,然而隨著檢測(cè)重?cái)?shù)的增加,形成二聚體甚至多聚體的可能性也大幅上升,輕則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn),靶標(biāo)擴(kuò)增效率下降,檢測(cè)靈敏度和特異性降低,重則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增占據(jù)主導(dǎo),靶標(biāo)擴(kuò)增失敗,造成假陽(yáng)性和/或假陰性,影響檢測(cè)準(zhǔn)確性[17]。

1.2.2 qPCR qPCR是在常規(guī)的PCR體系中添加熒光基團(tuán),利用機(jī)器監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化,可以實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)過(guò)程,以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性和相對(duì)定量。在物種鑒別中,qPCR是比較先進(jìn)的技術(shù),結(jié)果直觀易觀察,避免了瓊脂糖凝膠電泳中的污染問(wèn)題。

qPCR在靈敏度、多路復(fù)用、分析速度和成本方面超過(guò)了傳統(tǒng)技術(shù),是混合食品中摻假定量評(píng)估的首選方法。qPCR檢測(cè)中核酸被擴(kuò)增,并通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控測(cè)量來(lái)自雙鏈DNA結(jié)合染料釋放的熒光,其可在每個(gè)PCR循環(huán)中測(cè)量[18]。已有研究表明,用qPCR可同時(shí)檢測(cè)野味肉中的不同動(dòng)物物種,例如有學(xué)者檢測(cè)出了四種不同鹿肉的具體含量[19-22]。同樣,qPCR被用來(lái)檢驗(yàn)原料和加工清真產(chǎn)品中是否存在禁用的肉類(lèi)(如豬肉)[23-24]。關(guān)于海產(chǎn)品,最近已采用qPCR系統(tǒng)專(zhuān)門(mén)檢測(cè)金槍魚(yú)產(chǎn)品的欺詐或錯(cuò)誤標(biāo)簽[25]。

多重qPCR也被用來(lái)檢測(cè)乳制品的欺詐和錯(cuò)誤標(biāo)簽現(xiàn)象[26-28]。李志娟等[29]根據(jù)甲魚(yú)線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)甲魚(yú)特異性引物及Taq Man探針,用RT-qPCR方法檢測(cè)出市售假冒甲魚(yú)肉的存在,最低檢出濃度為0.005 ng/μL,且與其他肉源性成分均無(wú)交叉反應(yīng)。因?yàn)榘蠨NA區(qū)域具有高特異性,故可在低濃度下對(duì)肉制品中某些物種進(jìn)行定性檢測(cè),但不同的加工方式生產(chǎn)出來(lái)的肉制品(如加熱溫度不同)對(duì)PCR效率和精度有影響,使得絕對(duì)或相對(duì)量化具有一定局限性[30]。

1.2.3 數(shù)字PCR 數(shù)字PCR(ddPCR)從概念提出到商業(yè)化生產(chǎn)在短短幾十年間經(jīng)歷了飛速發(fā)展。根據(jù)分液方式的不同,數(shù)字PCR主要分為微孔板數(shù)字PCR、微滴數(shù)字PCR以及芯片數(shù)字PCR。最初,分配分子模板是在96/384孔微孔板中進(jìn)行,面對(duì)復(fù)雜的樣品仍采用手動(dòng)稀釋加樣方法,會(huì)帶來(lái)巨大加樣誤差。由于數(shù)字PCR技術(shù)的準(zhǔn)確程度取決于反映單元的總數(shù),即反映單元數(shù)目越多,越有利于數(shù)字PCR的準(zhǔn)確度。因此,96/384孔板也無(wú)法滿(mǎn)足反應(yīng)需要[31]。其中,ddPCR包括將擴(kuò)增反應(yīng)大量分配成納升大小的樣品,其被包封成油滴,以便在每個(gè)單獨(dú)的液滴上進(jìn)行一次PCR[32]。ddPCR在靈敏度與精密度方面均優(yōu)于qPCR,且無(wú)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可測(cè)量靶DNA含量,該技術(shù)已成功應(yīng)用于肉制品的鑒偽和定量[33]。

1.2.4 其他PCR鑒定方法 食品控制和真實(shí)性領(lǐng)域研究的主要目標(biāo)是開(kāi)發(fā)出一種可即時(shí)對(duì)食品進(jìn)行分析的技術(shù)。為此,基于PCR的方法與其它技術(shù)(如微流體、生物傳感器或納米技術(shù))的結(jié)合已經(jīng)引起了現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用領(lǐng)域?qū)W者們的興趣。

Furutani等[34]使用便攜式qPCR系統(tǒng),在20 min內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)加工食品中牛肉、豬肉、雞肉、兔肉、馬肉和羊肉的準(zhǔn)確鑒定。Lin等[35]報(bào)道了一種基于物種特異性探針的方法,該探針靶向細(xì)胞色素c氧化酶亞基1基因(COI)結(jié)合流通雜交檢測(cè),用于多種肉類(lèi)的鑒定(多重鑒定),因?yàn)樵摐y(cè)定快速且相對(duì)便宜,所以適合常規(guī)測(cè)試用。Wang等[36]描述了一種光學(xué)-薄膜-生物傳感器測(cè)試,該測(cè)試可以通過(guò)肉眼可感知的顏色變化監(jiān)測(cè)和區(qū)分多達(dá)八種肉類(lèi),檢測(cè)限低至0.001%。Kitpipit等[37]提到了一種可通過(guò)PCR擴(kuò)增,直接在樣品上檢測(cè)六種常見(jiàn)肉類(lèi)的方法,該方法可減少樣品前處理。在另一項(xiàng)研究中,有學(xué)者使用基于cytb基因?qū)α鱌alm PCR的超快速方法鑒定肉類(lèi),該方法具有很高的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用潛力[38],與標(biāo)準(zhǔn)PCR相比,該方法避免了反應(yīng)在不同溫度間的驟然變化,可使用單重或多重程序在24 min內(nèi)完成對(duì)目標(biāo)物種的檢測(cè),可檢測(cè)摻假量低至1%的肉制品。Taboada等[39]開(kāi)發(fā)了一種物種特異性四鏈體PCR系統(tǒng),并通過(guò)側(cè)流式試紙(LFD)進(jìn)行檢測(cè),以便在海產(chǎn)品中對(duì)兩種鱈魚(yú)物種進(jìn)行原位篩選。LFD因其具有便攜性和簡(jiǎn)單性,且可對(duì)結(jié)果進(jìn)行肉眼監(jiān)測(cè),而被證明有很強(qiáng)的實(shí)用性。據(jù)報(bào)道,在這種情況下使用基于凝膠的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的類(lèi)似多重PCR檢測(cè)方法可區(qū)分五種可食用或潛在可食用的水母物種[40]。

近五年來(lái),與PCR相關(guān)的技術(shù)應(yīng)用于肉制品鑒偽領(lǐng)域的代表性研究如表1所示。

表1 PCR相關(guān)的肉制品鑒偽技術(shù)

續(xù)表

2 DNA條碼

DNA條形碼由測(cè)序和比較直系同源DNA區(qū)域組成,用于分類(lèi)鑒定,是目前用于活體動(dòng)物生源地鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化方法[41]。目前,在動(dòng)物研究中,基于線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c的基因,通過(guò)使用短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段對(duì)物種進(jìn)行精準(zhǔn)識(shí)別和高效鑒定的方法已被廣泛應(yīng)用[42]。DNA條形碼,通過(guò)使用傳統(tǒng)的Sanger DNA測(cè)序儀或NGS技術(shù),有效推動(dòng)了食品種類(lèi)鑒定和可追溯性方面的進(jìn)步[43]。DNA條形碼技術(shù)的難點(diǎn)在于找到某種理想的目標(biāo)基因,這種基因在某個(gè)分類(lèi)群中呈現(xiàn)低變異性,但具有高水平的物種間變異性。因此,檢測(cè)幾個(gè)物種中的保守區(qū)域可達(dá)到區(qū)分物種的目的。用于區(qū)分物種的較有針對(duì)性的基因是COI、細(xì)胞色素b基因(cytb)和用于動(dòng)物物種鑒別的maturase K(matK)基因。這些基因相比線(xiàn)粒體和質(zhì)體DNA的優(yōu)勢(shì)在于其在細(xì)胞中存在較高數(shù)量的復(fù)制體,這也使其成為大多數(shù)定性方法中的目標(biāo)基因,其中需注意的是要用高靈敏度的方法來(lái)檢測(cè)低濃度的相應(yīng)物種的目標(biāo)基因[16]。由于DNA的降解,在中等或高度加工和保存的產(chǎn)品中對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度(約650 bp)條形碼的PCR擴(kuò)增是具有難度的。然而,專(zhuān)注于較短DNA片段(100～200 bp)的小型條碼編碼方法已通過(guò)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品認(rèn)證測(cè)試,成功率達(dá)到93%(使用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度條碼時(shí)為20.5%)[44]。

學(xué)者投入了大量精力創(chuàng)建了全球生命數(shù)據(jù)系統(tǒng)(BOLD),為幾乎所有生物創(chuàng)建了條形碼公共數(shù)據(jù)庫(kù)。與肉類(lèi)相比,可食用海產(chǎn)品和植物的多樣性更高,因此要區(qū)別相似的個(gè)體是具有難度的,特別是在加工食品中。在許多情況下,條形碼分析可以檢測(cè)到低百分比的錯(cuò)誤標(biāo)記,但由于物種的高度相似性,有時(shí)難以判斷欺詐是故意的還是無(wú)意的。此外,為了區(qū)分和識(shí)別不同魚(yú)類(lèi),目前已建立了包含所有魚(yú)類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)化參考序列的魚(yú)類(lèi)生命條形碼倡議(FISH-BOL)公共資料庫(kù)。如今,DNA條形碼技術(shù)已成功應(yīng)用于包括新鮮、冷凍和其它加工產(chǎn)品在內(nèi)的海產(chǎn)品的欺詐和錯(cuò)誤標(biāo)簽檢測(cè)[45-51]。

3 新型鑒偽技術(shù)

3.1 高通量測(cè)序

近年來(lái),DNA條形碼方法已被整合到高通量測(cè)序格式(原為下一代測(cè)序,NGS)中,證明了其具有同時(shí)鑒定食品中動(dòng)物和植物物種的高潛力。NGS對(duì)基因組研究產(chǎn)生了變革性的影響,其能夠并行地對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)小DNA片段進(jìn)行測(cè)序[52],且因NGS可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè),省去了反應(yīng)的后續(xù)步驟,故其比Sanger測(cè)序速度更快,通量更高。近年,DNA條形碼和焦磷酸測(cè)序技術(shù)的結(jié)合已成功用于魚(yú)類(lèi)、海產(chǎn)品[53-55]、肉及肉制品[56]的鑒定中。同樣,可以在乳制品中檢測(cè)到包括未申報(bào)物種和人類(lèi)DNA在內(nèi)的其它動(dòng)物物種來(lái)源[57]。

3.2 高分辨率熔解曲線(xiàn)分析其及延伸技術(shù)

高分辨率熔解曲線(xiàn)技術(shù)(HRM)是一種快速、高通量的技術(shù),其可根據(jù)反映遺傳變異的特定DNA擴(kuò)增子的解鏈溫度(Tm)進(jìn)行基因分型和序列匹配(以及因此對(duì)分類(lèi)群的區(qū)分)[58]。這種在PCR后使用熒光嵌入DNA染料的方法,當(dāng)溫度升高時(shí),可以監(jiān)測(cè)dsDNA變性情況。HRM的分辨能力依賴(lài)于序列分歧,因此,即使少數(shù)堿基對(duì)差異也會(huì)改變?nèi)劢馇€(xiàn),所以當(dāng)被分析的DNA序列相似度極高時(shí),要區(qū)分不同物種是比較困難的。HRM可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)8種不同的肉類(lèi)動(dòng)物,檢出限為0.1 ng DNA。在一項(xiàng)涉及蜂蜜的昆蟲(chóng)學(xué)鑒定的研究中,有學(xué)者通過(guò)分析蜂蜜樣品成功鑒定出了蜜蜂物種[59]。

2010年開(kāi)發(fā)的另一種方法是HRM與DNA條形碼的組合,稱(chēng)為Bar-HRM,當(dāng)用于物種和亞種分化時(shí),它有很大的潛力。該方法包括基于來(lái)自條形碼標(biāo)記的序列設(shè)計(jì)HRM特異性引物。與DNA條形碼技術(shù)相比,Bar-HRM的優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)現(xiàn)定量測(cè)量,且其具有比傳統(tǒng)熔解曲線(xiàn)分析更高的分辨率[60]。據(jù)報(bào)道,有學(xué)者用Bar-HRM區(qū)分了五種最具商業(yè)價(jià)值的蝦類(lèi),其鑒定精度達(dá)到99%以上[61]。另有學(xué)者采用相同的方法區(qū)分了五種鱈魚(yú)(高價(jià)值且易被摻假)[62]。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是日本學(xué)者Notomi在2000年提出的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)已被用于食品認(rèn)證領(lǐng)域。與PCR和qPCR一樣,LAMP也可以檢測(cè)特定的DNA序列,且可以測(cè)定多達(dá)八種不同的靶向序列。LAMP方法使用自我重復(fù)的鏈置換DNA合成,在恒定溫度下復(fù)制靶DNA,并避免了PCR擴(kuò)增的冗長(zhǎng)步驟[63]。

在關(guān)于清真食品的評(píng)估中,qLAMP以及針對(duì)豬肉特異性DNA的LAMP和電化學(xué)發(fā)光(ECL)傳感器的組合已經(jīng)可以檢測(cè)出含量低至0.01%的牛肉、豬肉和0.1 pg/μL的豬肉DNA[64-65]。LAMP-ECL傳感器除了具有高靈敏度外,還可以用作緊湊、簡(jiǎn)單、快速(約5 min檢測(cè))的生物傳感器,可用于現(xiàn)場(chǎng)食品認(rèn)證評(píng)估。有學(xué)者使用LAMP方法同時(shí)檢測(cè)了八種不同肉類(lèi)[66]。在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用方面,將特定的LAMP反應(yīng)與LFD組合可開(kāi)發(fā)出能夠檢測(cè)低至10 pg哺乳動(dòng)物物種DNA的快速測(cè)試生物傳感器[67]。

LAMP技術(shù)不需要進(jìn)行反復(fù)熱循環(huán)擴(kuò)增,避免了反復(fù)升降溫的耗時(shí)過(guò)程,可實(shí)現(xiàn)恒溫條件下的快速擴(kuò)增,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)的缺點(diǎn)。其通過(guò)加入熒光染料或熒光基團(tuán),利用目視比色或儀器法確定檢測(cè)結(jié)果,能較好地檢測(cè)出肉制品中的摻假情況。

4 經(jīng)典DNA標(biāo)記

廣泛用于群體遺傳學(xué)研究的經(jīng)典DNA標(biāo)記技術(shù),如微衛(wèi)星、RAPD、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLPs)、RFLP、序列特征擴(kuò)增區(qū)域和(最近)單核苷酸多態(tài)性(SNP)已被證實(shí)在肉制品鑒偽領(lǐng)域非常實(shí)用[2,68-69]。現(xiàn)多將其中的某幾種技術(shù)結(jié)合起來(lái)使用,如RFLP結(jié)合PCR也是一種基于DNA的分析方法,通?？捎糜谑称返奈锓N鑒定中。然而,這些技術(shù)相比于DNA條碼技術(shù),其靈敏度和選擇性低,且操作更為繁瑣。目前,PCR-RFLP已被廣泛用于鑒定海產(chǎn)品中摻雜的物種,并且該技術(shù)也適用于肉制品鑒偽。在RFLP中,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,使用酶消化靶DNA,并通過(guò)凝膠電泳監(jiān)測(cè)所得的限制性圖譜,即可通過(guò)比較不同樣品的圖譜來(lái)鑒別物種[70]。董傳舉等[71]通過(guò)PCR-RFLP技術(shù),使用一組引物分別對(duì)8種鱘魚(yú)線(xiàn)粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并分別應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶TaqαI、Ava II和Eag I-HF、Nae I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,使用3.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)其酶切結(jié)果,在保證魚(yú)種存活基礎(chǔ)上僅剪取少量魚(yú)鰭,便快速準(zhǔn)確地鑒別出了8種鱘魚(yú)易混種中的中華鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉以及歐鰉。韓鐫竹等[72]以純羊肉為原料,按2%、5%和10%的重量比在羊肉中摻雜雞肉、豬肉和鼠肉,通過(guò)基因組DNA提取試劑盒法提取DNA,并采用PCR-RFLP技術(shù)成功的同時(shí)檢測(cè)出羊肉中的摻雜肉類(lèi),檢出限為2%。Subbiah等[73]使用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)收集到的來(lái)自全國(guó)各地的樣本中的肉類(lèi)進(jìn)行了溯源性檢測(cè),并利用物種特異性PCR鑒定了肉牛和水牛樣品,在112份樣本中,鑒定出7.14%的雌性牛和56.25%的雄性牛,并檢測(cè)出有11個(gè)樣品為水牛和肉牛,有2個(gè)綿羊肉、1個(gè)山羊肉和2個(gè)雞肉樣品,此外還發(fā)現(xiàn)樣品中有駱駝肉的存在。Sunutcha等[74]基于PCR-RFLP技術(shù),測(cè)定了細(xì)胞色素b、12S和16S rRNA的PCR產(chǎn)物序列,并用Alu I和Hinf I兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割,成功的檢測(cè)并區(qū)分出泰國(guó)海域海蛇的血液、蛇皮、生肉、熟肉、海蛇-魚(yú)二元混合肉和海蛇-豬二元混合肉,該技術(shù)可應(yīng)用于海蛇肉制品市場(chǎng)的摻偽鑒別,且對(duì)于追蹤海蛇物種被捕獲的時(shí)間和評(píng)估泰國(guó)水域海蛇的保護(hù)和管理有重要意義。有學(xué)者通過(guò)靶向線(xiàn)粒體區(qū)域的PCR-RFLP區(qū)分了5種金槍魚(yú)種類(lèi)、9種不同的鯛魚(yú)種類(lèi)和16種商業(yè)海參種類(lèi)[75-77]。RFLP方法也被用于檢測(cè)混合物和肉丸中含量低至0.01%的貓肉[78]。盡管是最常用的技術(shù)之一,RFLP分析和其他經(jīng)典DNA標(biāo)記技術(shù)的使用也未必能獲得可靠的定量信息。此外,因?yàn)榉治龌诳梢耘c參考樣品比較的指紋樣擴(kuò)增模式,所以它們難以標(biāo)準(zhǔn)化。

SNP是單個(gè)位置的DNA序列變異,其已被證明在人類(lèi)疾病的診斷中非常有用。SNP分析可以區(qū)分那些親緣關(guān)系很近的樣本[79],因?yàn)榉治鰝?cè)重于單核苷酸變化而不是整個(gè)序列,所以該方法特別適用于鑒定相似度高的品種[80]。表2匯編了使用這些經(jīng)典DNA標(biāo)記進(jìn)行食品認(rèn)證的最新研究。

表2 經(jīng)典DNA標(biāo)記物在食品鑒偽方面的應(yīng)用

5 結(jié)論與展望

對(duì)于肉制品的鑒偽方法,其首先必須滿(mǎn)足準(zhǔn)確和可靠的要求。此外,由于高度分散的靶DNA分子間的差異性很小,且十分敏感,因此,鑒偽方法還應(yīng)具有高度特異性。同時(shí),鑒偽方法應(yīng)具有高通量能力、分析時(shí)間短的特點(diǎn),以便快速的檢測(cè)出摻假成分。目前開(kāi)發(fā)的鑒偽技術(shù)如NGS、DNA-metabarcoding、Bar-HRM、LAMP和ddPCR等已經(jīng)超越了傳統(tǒng)的鑒偽方法。

目前,納米粒子已經(jīng)被納入食品應(yīng)用,例如過(guò)敏原和有毒化合物的檢測(cè)[81-82]以及食品安全認(rèn)證[83]。而采用微流體裝置和納米粒子,改進(jìn)了復(fù)雜食品基質(zhì)DNA的回收和提取過(guò)程[84-85],為肉制品鑒偽技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了技術(shù)支持。在未來(lái)的鑒偽技術(shù)中,把數(shù)字PCR和LAMP等技術(shù)與微流體和納米流體系統(tǒng)以及新型納米生物傳感器系統(tǒng)結(jié)合,將會(huì)顯著提高這些基于DNA的鑒偽方法的效力[86-88]?；诩{米粒子的生物傳感器,由于可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的平行試驗(yàn),且具有便攜式分析平臺(tái),省去了傳統(tǒng)方法中樣品制備的繁瑣操作,也將會(huì)成為今后的重要研究趨勢(shì)之一。