藍(lán)圓鲹分離蛋白水溶性蛋白酶的鑒定及性質(zhì)

林怡晨，劉偉峰，孫小舒，張凌晶，翁 凌，2，曹敏杰，2，孫樂(lè)常，2，3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

藍(lán)圓鲹(Decapterusmaruadsi)隸屬鱸形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)，屬于暖水性中上層魚(yú)類，是我國(guó)重要的低值海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年，全國(guó)藍(lán)圓鲹捕撈量總計(jì)達(dá)53.5萬(wàn)t，其中福建省捕撈量為24.3萬(wàn)t，居全國(guó)首位，具有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[1]。目前，藍(lán)圓鲹主要被加工成魚(yú)干、魚(yú)露或腌制品等低值產(chǎn)品，精深加工程度較低。隨著海洋漁業(yè)資源的日益縮減，藍(lán)圓鲹逐漸取代傳統(tǒng)的魚(yú)糜原料魚(yú)被應(yīng)用于魚(yú)糜制品的加工。

等電點(diǎn)沉淀法(isoelectric solubilization/precipitation，ISP)是一種利用蛋白質(zhì)在不同pH值下的溶解度不同的原理，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解、沉淀從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離的技術(shù)。近年來(lái)，有研究者開(kāi)始嘗試?yán)肐SP代替?zhèn)鹘y(tǒng)魚(yú)糜加工中的漂洗工序制備魚(yú)類肌肉分離蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISP不僅可以分離油脂、色素以及魚(yú)鱗等其他雜質(zhì)，還可有效回收水溶性蛋白質(zhì)，從而顯著提高蛋白質(zhì)的回收率，避免優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的浪費(fèi)[2-3]。課題組在前期研究中利用酸/堿ISP法從藍(lán)圓鲹肌肉中制備獲得分離蛋白，證實(shí)ISP法不僅能極大提高肌肉中蛋白質(zhì)的回收率，其制備得到的分離蛋白還具有更好的消化性[4]。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)圓鲹分離蛋白在加熱凝膠化過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)類似凝膠劣化的現(xiàn)象。前期研究中，通過(guò)觀察肌球蛋白在ISP法pH值調(diào)節(jié)過(guò)程中的構(gòu)象變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)酸法ISP分離蛋白的弱凝膠是由于肌球蛋白變性導(dǎo)致，而堿法ISP制備得到的肌球蛋白能基本保持天然肌球蛋白的構(gòu)象與凝膠化能力[5]。由此可見(jiàn)，堿法ISP分離蛋白的凝膠劣化極可能是由其內(nèi)源性蛋白酶的水解作用導(dǎo)致。目前，關(guān)于誘導(dǎo)傳統(tǒng)魚(yú)糜凝膠劣化內(nèi)源性蛋白酶的研究在白姑魚(yú)(Pennahiaargentata)[6]、馬鮫魚(yú)(Scomberomorusniphonius)[7]、白鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)[8]等魚(yú)類已有較多報(bào)道。這些結(jié)果普遍表明，組織蛋白酶L和肌原纖維結(jié)合型的絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase，MBSP)是誘導(dǎo)魚(yú)糜凝膠劣化的主要內(nèi)源性蛋白酶。對(duì)于藍(lán)圓鲹，文獻(xiàn)[9-10]純化得到肌肉中的MBSP和組織蛋白酶L，通過(guò)對(duì)比二者對(duì)肌原纖維蛋白的降解情況，發(fā)現(xiàn)MBSP具有更高的肌原纖維蛋白水解活性，推測(cè)其在傳統(tǒng)魚(yú)糜制品的凝膠劣化中起更重要的作用。值得注意的是，ISP法能夠同時(shí)有效回收肌原纖維蛋白與水溶性蛋白，水溶性蛋白往往含有高活性的水溶性蛋白酶?？紤]到ISP法制備分離蛋白過(guò)程中pH值的變化也會(huì)對(duì)內(nèi)源性蛋白酶的活性產(chǎn)生重要影響，筆者推測(cè)，ISP分離蛋白的凝膠劣化機(jī)制可能不同于傳統(tǒng)的魚(yú)糜制品。然而，目前針對(duì)因酶誘導(dǎo)的ISP分離蛋白凝膠劣化作用機(jī)理的研究至今還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以藍(lán)圓鲹肌肉分離蛋白為對(duì)象，分析比較不同分離蛋白的自身降解規(guī)律，結(jié)合特異性熒光底物與肌原纖維酶譜對(duì)內(nèi)源性蛋白酶進(jìn)行研究，以期為魚(yú)類ISP分離蛋白的凝膠劣化機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)圓鲹，每尾約150 g，購(gòu)于廈門市集美菜市場(chǎng)。

綠豆胰蛋白酶抑制劑(mung bean trypsin inhibitor，MBTI)是本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的。SDS-PAGE用標(biāo)準(zhǔn)蛋白購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó))；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA等MCA熒光合成底物購(gòu)于Peptide Institute公司(日本)；十二烷基磺酸鈉(SDS)，乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，Trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)butane(E-64)，Leupeptin，Bestatin，4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid-hydrochloride(AEBSF)，Pepstatin，購(gòu)于Sigma公司(美國(guó))；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純。

PT-2100組織搗碎機(jī)(Kinematica公司，瑞士)；UB-7型pH計(jì)(梅特勒公司，瑞士)；Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)(Beckman 公司，美國(guó))；Mini-PROTEAN蛋白質(zhì)電泳裝置(Bio-Rad公司，美國(guó))；G：BOX凝膠成像儀(Syngene公司，英國(guó))；FR-8200熒光分光光度計(jì)(JASCO公司，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離蛋白制備

以下操作若無(wú)特殊說(shuō)明，所有操作均在4 ℃下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)采用酸、堿ISP法制備分離蛋白，并同時(shí)以肌肉中全蛋白(total protein，TP)作為對(duì)照進(jìn)行比較。其中，藍(lán)圓鲹肌肉TP是直接采取新鮮藍(lán)圓鲹的骨骼肌，并用絞肉機(jī)攪碎，其中的蛋白質(zhì)即為全蛋白組；藍(lán)圓鲹骨骼肌酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀的分離蛋白(acid/alkaline aided solubilized-isoelectric solubilization/precipitation，API/KPI)則參考前期研究已報(bào)道的方法[4]制備，具體操作過(guò)程為：藍(lán)圓鲹肌肉與冰水以1∶8的質(zhì)量比混合并組織搗碎，分別用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為2.0和11.0進(jìn)行溶解，離心后收集上清液部分，并調(diào)節(jié)pH值至5.5，經(jīng)離心后收集沉淀部分蛋白質(zhì)，加入適量的碳酸氫鈉調(diào)pH值至中性，即為API與KPI。

1.2.2 分離蛋白自身降解規(guī)律研究

在得到的三組蛋白質(zhì)樣品中加入7.5倍體積的緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH=8.0)組織搗碎，取100 μL分裝于1.5 mL的離心管中，在50 ℃分別孵育0，15，30，60，120 min。孵育結(jié)束后，立即加入2倍體積的蛋白質(zhì)溶解液(20 mmol/L Tris-HCl ，pH=8.0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% SDS，8 mol/L尿素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%β-巰基乙醇)，并于95 ℃加熱20 min，完全溶解后的樣品參照Laemmli等[11]方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 水溶性蛋白酶的提取

取TP、API和KPI 各100 g，分別加入4倍體積的緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0)中組織搗碎，搗碎后勻漿，12 000g離心取上清，即為粗酶液，分別命名為WTP、WAPI和WKPI。

1.2.4 酶活力測(cè)定

酪蛋白TCA可溶性肽含量測(cè)定法[12]：取100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入至900 μL的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酪蛋白的緩沖液B中，40 ℃孵育30 min，立即加入300 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%TCA終止反應(yīng)，得到的反應(yīng)液經(jīng)8 000g離心10 min后收集上清液。通過(guò)Lowry法[13]測(cè)定上清液的可溶性肽含量，并用酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)。活力單位(U)定義為每分鐘釋放1 μmol酪氨酸所需要的酶量。

肌原纖維酶譜法[12]：為避免藍(lán)圓鲹肌肉肌原纖維蛋白中結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)[9]對(duì)肌原纖維蛋白的降解干擾，本實(shí)驗(yàn)以不易發(fā)生自身降解的羅非魚(yú)肌原纖維蛋白為底物進(jìn)行肌原纖維蛋白酶譜檢測(cè)。具體步驟為：添加羅非魚(yú)肌肉肌原纖維蛋白到SDS-PAGE凝膠中使其終質(zhì)量濃度為1.0 g/L。將酶與SDS上樣緩沖液混勻后，直接上樣，并在低溫條件下進(jìn)行電泳。結(jié)束后，將膠取出，放入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% Triton X-100的冰水中振蕩孵育以去除SDS使酶復(fù)性，隨后將凝膠置入緩沖液B中，在37 ℃下孵育24 h，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色。羅非魚(yú)肌原纖維蛋白參考Rawdkuen等[14]的方法進(jìn)行制備。

1.2.5 溫度和pH值對(duì)蛋白酶的影響

1)最適溫度：取100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入至900 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酪蛋白的緩沖液B中，分別在20～70 ℃下孵育，通過(guò)1.2.4方法測(cè)定酶活力。

2)最適pH值：取100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入至900 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酪蛋白的不同pH值緩沖液中，通過(guò)1.2.4方法測(cè)定酶活力。其中不同pH值的緩沖溶液分別為：NaCl-HCl緩沖液(pH=2.0)，甘氨酸-HCl緩沖液(pH=3.0)，乙酸鈉緩沖液(pH=4.0～5.0)，磷酸緩沖液(pH=6.0～7.0)，Tris-HCl(pH=8.0)，甘氨酸-NaOH(pH=9.0～10.0)，磷酸氫二鈉-NaOH(pH=11.0)。

3)pH值穩(wěn)定性：取20 μL酶液與80 μL 100 mmol/L的不同pH值緩沖液(pH=2.0～11.0)混合，在室溫下放置30 min后加入至900 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酪蛋白的50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，按1.2.4的方法測(cè)定酶活力。

1.2.6 蛋白酶對(duì)肌原纖維的降解以及蛋白酶抑制劑的影響測(cè)定

將蛋白酶與不同類型抑制劑混勻，于冰上放置30 min充分反應(yīng)后，按照體積比1∶2與含羅非魚(yú)肌原纖維(6 g/L)的緩沖液A混勻，置于50 ℃孵育120 min，隨后進(jìn)行SDS-PAGE分析。所加入抑制劑及其在體系終濃度為： MBTI，0.02 g/L；AEBSF，1 mmol/L；Leupeptin，100 μmol/L；E-64，10 μmol/L；EDTA，10 mmol/L；EGTA，10 mmol/L；Bestatin，10 μmol/L；Pepstain A，1 μmol/L。

1.2.7 熒光底物分析

1)熒光底物特異性分析：參考游銀川的方法[15]，在900 μL 20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)中加入50 μL的酶樣和50 μL 10 μmol/L的熒光底物，振蕩混勻。50 ℃孵育30 min，加入1.5 mL終止液(V(水)∶V(甲醇)∶V(異丙醇)=35∶35∶30)終止反應(yīng)。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液在激發(fā)波長(zhǎng)380 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm的熒光度值，對(duì)照組用緩沖液代替熒光底物。酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin，AMC)所需酶量。不同類型熒光底物有：Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，Boc-Gln-Arg-Arg-MCA，Boc-Gln-Ala-Arg-MCA，Boc-Ala-Gly-Pro-Arg-MCA，Boc-Arg-Val-Arg-Arg-MCA，Boc-Leu-Gly-Arg-MCA，Boc-Val-Leu-Lys-MCA，Suc-Leu-Leu-Val-Tyr- MCA，Suc-Glu-Pro-MCA，Z-Arg-Arg-MCA，Z-Leu-Arg-MCA，Leu-MCA，Lys-MCA。

2)抑制劑對(duì)蛋白酶分解熒光底物的影響：在20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)的緩沖液中，將蛋白酶與不同的抑制劑相混合，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA作為熒光底物，在50 ℃水浴鍋中進(jìn)行孵育，測(cè)定酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次以上，用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求平均值、偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)圓鲹分離蛋白的自身降解

將3組蛋白質(zhì)樣品置于50 ℃孵育不同時(shí)間觀察自身降解情況，結(jié)果如圖1所示?？梢?jiàn)，3組蛋白質(zhì)均可觀察到明顯的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白條帶(圖1箭頭標(biāo)記)。此外，ISP法制備得到的KPI蛋白條帶組成上與TP組相似，這說(shuō)明堿法ISP能有效回收水溶性蛋白質(zhì)組分。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)酸、堿ISP法可以分別回收65.0%與84.6%的肌肉總蛋白，這與圖1的結(jié)果相一致。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，3組蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的自身降解現(xiàn)象，其中，TP的分解最強(qiáng)烈，反應(yīng)30 min其MHC條帶幾乎完全分解。相比于TP組，KPI組的自身降解相對(duì)較弱，但明顯強(qiáng)于API組。前期研究的流變學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP與KPI均能在50～60 ℃升溫過(guò)程中發(fā)生凝膠劣化[4]。本結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，此凝膠劣化現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)發(fā)生自身降解導(dǎo)致的。

2.2 水溶性蛋白酶酶活力

為了進(jìn)一步闡明圖1中不同組分離蛋白自身降解速度的差異，對(duì)其水溶性蛋白酶的酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2a所示。與對(duì)照組(WTP)相比，API上清液的蛋白酶相對(duì)酶活力(以下簡(jiǎn)稱WAPI)僅為10%，而KPI的上清液(以下簡(jiǎn)稱WKPI)則保留了80%以上的蛋白酶活性。通過(guò)肌原纖維酶譜(圖2b)可以看出,TP與KPI中主要存在3種能特異性分解肌原纖維蛋白的蛋白酶，其分子質(zhì)量分別約為120，110與70 ku。相對(duì)于TP與KPI，API則沒(méi)有檢測(cè)到能降解肌原纖維蛋白的亮帶，表明API中相關(guān)內(nèi)源性蛋白酶的活性極低，這與圖2a的結(jié)果一致。此外，Sun等[12]利用ISP法從太平洋磷蝦中制備得到分離蛋白，并在酶譜與酪蛋白水解活力測(cè)定中也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律。這也暗示了相對(duì)于酸性pH值，水溶性蛋白酶在堿性條件下具有更好的穩(wěn)定性。

2.3 溫度和pH值對(duì)水溶性蛋白酶活力的影響

以酪蛋白為底物，測(cè)定WTP與WKPI中蛋白酶的最適溫度、最適pH值與pH值穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。可見(jiàn)，WTP與WKPI最適溫度均為60 ℃，且溫度上升至70 ℃時(shí)，酶活力快速下降。WTP的pH=9.0與pH=3.0均表現(xiàn)出最高的水解酪蛋白活性，且在pH=5.0處出現(xiàn)一個(gè)峰肩，表明TP中存在堿性蛋白酶(如絲氨酸類蛋白酶)、酸性蛋白酶(如組織蛋白酶D)以及組織蛋白酶B/L[9]。此結(jié)果與文獻(xiàn)[16-18]報(bào)道的鯖魚(yú)和虱目魚(yú)的組織蛋白酶D(最適pH=3.0)、鯖魚(yú)的組織蛋白酶B(最適=5.5)、鰱魚(yú)組織蛋白酶L(最適pH=5.0～5.5)，以及藍(lán)圓鲹肌肉絲氨酸蛋白酶(最適pH=9.0)[19]等魚(yú)類內(nèi)源性蛋白酶的最適pH值結(jié)果相似。

另一方面，WKPI則僅在pH=9.0具有最高的酪蛋白水解活力。通過(guò)對(duì)WTP內(nèi)源酶在不同pH值下的穩(wěn)定性，可以看出酸性蛋白酶類在堿性pH值范圍并不穩(wěn)定，特別在pH=11.0時(shí)，基本喪失全部水解活力。相比之下，WTP中的堿性蛋白酶在堿性pH值下具有良好的穩(wěn)定性，當(dāng)pH=11.0時(shí)，依然能保留70%的活力，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了圖3b中WKPI的最適pH值結(jié)果。

2.4 水溶性蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)肌原纖維的降解

將WTP和WKPI加入至羅非魚(yú)的肌原纖維中，并加入不同的蛋白酶抑制劑觀察降解情況，結(jié)果如圖4所示。圖4的SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WKPI的蛋白質(zhì)條帶要明顯少于全蛋白，推測(cè)在pH值調(diào)節(jié)過(guò)程中，部分肌漿蛋白發(fā)生變性進(jìn)而產(chǎn)生沉淀。

羅非魚(yú)肌原纖維經(jīng)50 ℃孵育4 h后，空白組沒(méi)有檢測(cè)到明顯的自身降解，而加入WTP和WKPI的肌原纖維蛋白組可以觀察到肌球蛋白重鏈(MHC)被完全降解。為了更好判斷水溶性蛋白酶的類型，孵育過(guò)程中加入了不同類型抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有抑制劑均無(wú)法完全抑制藍(lán)圓鲹肌漿蛋白酶降解羅非魚(yú)肌原纖維，說(shuō)明藍(lán)圓鲹的肌漿蛋白酶包含了多種類型的蛋白酶，這與WTP最適pH值的結(jié)果一致(見(jiàn)圖3c)。而對(duì)于添加WKPI組，抑制劑的抑制作用則相對(duì)更為明顯，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑MBTI、Leupeptin以及Antipain對(duì)MHC的降解抑制效果最為顯著，而金屬蛋白酶抑制劑EDTA、EGTA，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64，天冬氨酸蛋白酶抑制劑Pepstain A以及氨肽酶抑制劑Bestatin對(duì)內(nèi)源酶的水解具有部分抑制作用。以上結(jié)果表明，在pH=8.0條件下，藍(lán)圓鲹肌肉中分解肌原纖維蛋白的主要內(nèi)源酶為絲氨酸蛋白酶類型。此外，相對(duì)于分離蛋白組，肌肉中的內(nèi)源酶種類更為復(fù)雜。

2.5 水溶性蛋白酶對(duì)MCA底物水解特性

利用熒光底物對(duì)WTP與WKPI中內(nèi)源酶的種類進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，結(jié)果如表1所示。在反應(yīng)pH=8.0時(shí)，WTP和WKPI對(duì)羧基端P1位為Arg殘基的多肽具有特異的水解活性，尤其是Boc-Gln-Arg-Arg-MCA，表明在該pH值條件下起主要水解活性的是胰蛋白酶類型的絲氨酸蛋白酶。

以通用熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為對(duì)象，考察不同抑制劑對(duì)WTP與WKPI內(nèi)源性蛋白酶酶活力的影響，結(jié)果如表2所示。MBTI、AEBSF和Leupeptin均對(duì)蛋白酶活性有顯著抑制作用，這也進(jìn)一步證明了分離蛋白中的內(nèi)源酶屬于胰蛋白酶類型。此外，金屬螯合劑EDTA對(duì)內(nèi)源酶具有部分抑制作用，推測(cè)可能是由于其活性中心的金屬離子被螯合所致。

表1 藍(lán)圓鲹分離蛋白內(nèi)源性蛋白酶的底物特異性分析Tab.1 Substrates specificity analysis of endogenousproteinases from blue round scads protein isolates底物Substrates(10 μmol/L)相對(duì)活性Relative activity/%WTPWKPIBoc-Phe-Ser-Arg-MCA100.0100.0Boc-Gln-Arg-Arg-MCA476.0358.3Boc-Gln-Ala-Arg-MCA187.0216.4Boc-Ala-Gly-Pro-Arg-MCA71.883.8Boc-Leu-Gly-Arg-MCA37.961.1Boc-Val-Leu-Lys-MCA29.730.7Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA9.14.5Suc-Glu-Pro-MCA0.70.6Z-Arg-Arg-MCA38.443.2Z-Phe-Arg-MCA23.118.7Leu-MCA8.61.3Lys-MCA7.80.5表2 抑制劑對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白內(nèi)源性蛋白酶的影響Tab.2 Effect of inhibitors on endogenousproteinases from blue round scads protein isolates抑制劑Inhibitor抑制劑濃度Inhibitorconcentration相對(duì)活性Relative activity/%WTPWKPIControl0100.0100.0MBTI0.01 mg/L14.810.3AEBSF1 mmol/L8.17.9Leupeptin0.1 mmol/L9.66.1E-640.01 mmol/L84.6100.0EDTA10 mmol/L35.324.5EGTA10 mmol/L36.624.5Bestatin0.01 mmol/L100.097.4Pepstain A0.001 mmol/L100.092.2

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)圓鲹為對(duì)象，比較分析了肌肉與ISP分離蛋白中水溶性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，藍(lán)圓鲹肌肉中存在多種水溶性蛋白酶，而經(jīng)過(guò)酸法ISP制備后分離蛋白中的內(nèi)源酶酶活性基本喪失。相比之下，堿法ISP制備的分離蛋白中則保留較高活力的水解活性，且其主要的內(nèi)源性蛋白酶為胰蛋白酶類型，提示該酶可能是誘導(dǎo)引起堿法ISP分離蛋白魚(yú)糜凝膠劣化的主要原因。