旋毛蟲肌幼蟲期外泌體的分離和小RNA鑒定

高 欣，楊 勇，劉 蕾，劉曉雷，劉明遠(yuǎn)，白 雪

2014年，世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)根據(jù)寄生蟲對(duì)人體造成的損傷以及經(jīng)濟(jì)損失的綜合評(píng)估，將旋毛蟲列為食源性寄生蟲之首[1]。自Page和Owen于1835年首次在人體尸檢的肌肉中發(fā)現(xiàn)，但到目前為止，旋毛蟲的具體感染機(jī)制仍不清楚[2]。研究表明，旋毛蟲蟲體粗提物和排泄分泌產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)宿主強(qiáng)烈的Th2型免疫反應(yīng)，引起宿主免疫抑制，最終建立慢性感染從而達(dá)到長(zhǎng)期寄生[3]。大量實(shí)驗(yàn)證明旋毛蟲蟲體粗提物或排泄分泌產(chǎn)物中存在可調(diào)控宿主免疫細(xì)胞、參與旋毛蟲與宿主的相互作用的關(guān)鍵分子[4]。外泌體(exosomes, EXO)是一種表面為磷脂膜的分泌小泡，幾乎所有細(xì)胞都能產(chǎn)生，存在于生物體液中，包括腹水、膽汁、母乳等[5]。EXO攜帶多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、miRNA和mRNA，EXO與靶細(xì)胞融合后，其攜帶的蛋白質(zhì)和RNA轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，進(jìn)而影響靶細(xì)胞的功能[6]。

研究表明，包括肝片吸蟲、蛔蟲、棘球絳蟲等在內(nèi)的很多寄生蟲可以分泌外泌體作用于宿主細(xì)胞，調(diào)控宿主的基因表達(dá)和免疫反應(yīng)，參與寄生蟲致病過程[7]。2018年，Li Y等[8]發(fā)現(xiàn)弓形蟲釋放的EXO能夠激活巨噬細(xì)胞，刺激促炎因子分泌，觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)，對(duì)弓形蟲感染進(jìn)行局部保護(hù)。Fromm B等[9]發(fā)現(xiàn)肝片吸蟲釋放的EXO含有10個(gè)與宿主同源的miRNA，提示EXO可能干預(yù)宿主的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。Eline P. Hansen等[10]發(fā)現(xiàn)蛔蟲EXO中的miRNA可以靶向宿主體內(nèi)編碼免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，從而調(diào)控宿主免疫反應(yīng)。因此，EXO在細(xì)胞間通過傳遞效應(yīng)分子進(jìn)而介導(dǎo)寄生蟲與宿主之間的相互作用，這些研究提示，旋毛蟲也可能分泌EXO調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，從而成功寄生[11]。

本研究采用超速離心法從旋毛蟲肌幼蟲培養(yǎng)上清中成功獲得EXO，并應(yīng)用透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析、免疫印跡以及小RNA測(cè)序?qū)λ@的EXO進(jìn)行鑒定，為今后深入研究旋毛蟲肌幼蟲期EXO(ML-EXO)參與炎癥及其他生物學(xué)過程提供基礎(chǔ)，并為旋毛蟲病的致病機(jī)制及靶向治療提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與旋毛蟲蟲種 Wistar雌性大鼠8只，體重180～200 g(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心)，用于旋毛蟲傳代保種及旋毛蟲肌幼蟲期外泌體的收集。中國(guó)河南豬旋毛蟲分離株T.spiralis(ISS534)由本室傳代保種。

1.1.2主要試劑 胃蛋白酶、鹽酸均購(gòu)于中國(guó)惠世生化試劑有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、10 000 U/mL青霉素、10 000 U/mL鏈霉素、胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司，戊二醛、磷鎢酸均購(gòu)于無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司，BCA試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠CD63多克隆抗體、山羊抗鼠Enolase多克隆抗體均購(gòu)于Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、驢抗山羊IgG均購(gòu)于Cell Signaling公司，Tru Seq小RNA文庫制備試劑盒購(gòu)于Illumina公司。

1.2 方 法

1.2.1旋毛蟲肌幼蟲的收集 取8只Wistar大鼠，經(jīng)口感染3 500條旋毛蟲肌幼蟲，于感染后35 d(dpi)脫頸處死，去其皮膚、脂肪、四肢、內(nèi)臟等。在顯微鏡下觀察膈肌，確定有旋毛蟲肌幼蟲后，將胴體和膈肌絞碎，放入人工消化液(10 mL/L濃鹽酸和10 g/L胃蛋白酶)中，在37 ℃下恒溫消化2 h。液體過篩網(wǎng)并自然沉淀1 h，加入清水洗滌直至液體清亮，收集旋毛蟲肌幼蟲[12]。

1.2.2旋毛蟲肌幼蟲期外泌體的提取 本實(shí)驗(yàn)采用超速離心法提取旋毛蟲肌幼蟲期EXO(ML-EXO)。將旋毛蟲肌幼蟲用含5%雙抗(10 000 U/mL青霉素、10 000 U/mL鏈霉素)的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基清洗5次后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用800 mL含2%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。收集旋毛蟲肌幼蟲培養(yǎng)液，分裝于50 mL離心管中，首先于4 ℃下800 g離心15 min，去除蟲體。取上清置于新的離心管中，于4 ℃下5 000 g離心15 min以去除雜質(zhì)。收集上清，使用0.22 μm過濾器過濾后轉(zhuǎn)移到10 kDa超濾管中進(jìn)行超濾，4 ℃下5 000 g離心15 min。所得上清于4 ℃下120 000 g離心2 h，棄去上清，沉淀即為ML-EXO[13]。100 μL PBS重懸EXO，—80 ℃保存，以備后續(xù)使用。

1.2.3透射電子顯微鏡觀察旋毛蟲肌幼蟲期外泌體形態(tài) 采用透射電子顯微鏡的方法對(duì)ML-EXO形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。將純化后的EXO在PBS中重懸后，取10 μL ML-EXO懸浮液置于銅網(wǎng)，靜置1 min后，用濾紙將液體吸去，采用3%磷鎢酸鈉溶液室溫負(fù)染2 min，室溫風(fēng)干，置于透射電子顯微鏡(Hitachi H-7650)下觀察ML-EXO形態(tài)，在80 kV下調(diào)節(jié)亮度及焦距進(jìn)行圖像采集[14]。

1.2.4納米顆粒跟蹤分析法檢測(cè)旋毛蟲肌幼蟲期外泌體大小 將ML-EXO沉淀用1 mL PBS重懸制成1 mL 0.5 g/L的溶液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后置于冰上。按照納米顆粒跟蹤分析儀(Nanno Sight NS3000)操作流程，調(diào)整參數(shù)，檢測(cè)EXO的粒子數(shù)目、濃度以及粒徑分布，收集并保存數(shù)據(jù)[15]。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測(cè)旋毛蟲肌幼蟲外泌體的CD63和Enolase蛋白水平 通過BCA測(cè)定ML-EXO濃度，將其充分裂解，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，每孔上樣30 μg蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。然后加入兔抗鼠CD63(1∶1 000)、山羊抗鼠Enolase多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，使用1×TBST緩沖液洗3次。再分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)、驢抗山羊IgG(1∶50 000)，室溫孵育2 h，使用1×TBST緩沖液洗3次，加入化學(xué)發(fā)光顯色液，應(yīng)用凝膠成像分析進(jìn)行分析[16]。

1.2.6旋毛蟲肌幼蟲外泌體中小RNA的高通量測(cè)序 采用Trizol方法從ML-EXO中提取總RNA，采用Agilent 2100系統(tǒng)分析RNA質(zhì)量[17]。使用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離18～30 nt之間的小RNA，使用Tru Seq小RNA文庫制備試劑盒構(gòu)建小RNA文庫。經(jīng)檢測(cè)合格后的小RNA，在Illumina HiSeq2000測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序分析。本研究的小RNA文庫構(gòu)建和測(cè)序均由深圳華大基因公司完成。

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)，首先去除測(cè)序質(zhì)量較低、不確定堿基大于10%、5′接頭污染、無插入片段、無3′接頭、包含polyA、小于18 nt的片段，得到clean reads。通過blast或bowtie將clean reads和miRBase、GenBank、Rfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定出與數(shù)據(jù)庫中完全匹配的小RNA。將測(cè)序后的小RNA進(jìn)行分類注釋，包括rRNA、snRNA、tRNA、miRNA等。對(duì)于miRNA的分析，通過targetscan和miRanda軟件，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，應(yīng)用GO功能和ggplot2分析研究靶基因的生物學(xué)功能。

2 結(jié) 果

2.1旋毛蟲肌幼蟲期外泌體形態(tài)學(xué)觀察 將超速離心法分離純化獲得的ML-EXO，置于40 000倍透射電子顯微鏡下觀察，可見EXO呈典型的橢圓形或圓形的杯狀形態(tài)，具有明顯的膜結(jié)構(gòu)，其腔內(nèi)有低密度顆粒，背景清晰，無污染，符合EXO在透射電子顯微鏡下的特征(圖1)。利用納米顆粒跟蹤分析法對(duì)所提取ML-EXO的粒徑進(jìn)行檢測(cè)，做出分析報(bào)告(表1)。其中直徑80～200 nm約占83%，200～300 nm約占12%，300～500 nm約占5%，可以看出ML-EXO大多數(shù)處于80～200 nm直徑范圍。

2.2Western blotting檢測(cè)旋毛蟲肌幼蟲期外泌體特異性標(biāo)記物 采用免疫印記法，對(duì)旋毛蟲肌幼蟲及其EXO進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示旋毛蟲肌幼蟲及其EXO均表達(dá)特異性標(biāo)記蛋白CD63和Enolase，大小分別是43 kDa和49 kDa(圖2)。

圖1 透射電子顯微鏡觀察旋毛蟲肌幼蟲期外泌體的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characterization of T. spiralis muscle larvae exosomes under TEM

表1 旋毛蟲肌幼蟲期外泌體不同大小的百分比
Tab.1 Percentage ofT.spiralismuscle larvae EXO in various size range

Particle size/nmnumber %0-80080-20083200-30012300-5005500-10000

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)旋毛蟲肌幼蟲期外泌體特異性標(biāo)記蛋白CD63和Enolase蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of specific markers CD63 and Enolase in T. spiralis muscle larvae EXO by western blotting

2.3旋毛蟲肌幼蟲期外泌體的小RNA分析 將所有ML-EXO中的小RNA與各類RNA的比對(duì)、注釋情況進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ML-EXO小RNA文庫中，來源于編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子和外顯子共6 764種，約占小RNA的0.55%，表明總RNA質(zhì)量完好，基本沒有降解。各類非編碼小RNA共206 120種，占小RNA的16.64%，其中rRNA的比例最高，占12.80%。未注釋的小RNA共959 200種，占小RNA的77.45%，這部分序列可能是新小RNA序列，其分類和功能值得進(jìn)一步研究(圖3A)。通過將小RNA和miRBase數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定出已知miRNA共66 352種，占小RNA的5.36%。對(duì)已知miRNA用多個(gè)軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)靶基因數(shù)量為34 437個(gè)(表2)。為了確定預(yù)測(cè)的靶基因行使的主要生物學(xué)功能，本研究通過GO富集分析靶基因的功能分類體系，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞、生物學(xué)調(diào)節(jié)、代謝等過程中，靶基因顯著富集(圖3B)。進(jìn)一步利用ggplot2對(duì)豐度前50的miRNA的靶基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其參與了多種免疫調(diào)節(jié)如MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、JNK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和B細(xì)胞活化等過程(圖3C)。

A為小RNA的種類；B為miRNA的GO功能分析；C為miRNA對(duì)免疫相關(guān)靶基因的調(diào)節(jié)分析圖3 旋毛蟲肌幼蟲期外泌體中的小RNA分析Fig.3 Small RNA analysis in T. spiralis muscle larvae EXO

表2 旋毛蟲肌幼蟲期外泌體中的miRNA靶基因預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)
Tab.2 Summary ofT.spiralismuscle larvae EXO miRNA target prediction

softwaremiRNA numberTarget gene numberCount of miRNA::corresponding target geneTarget location numbertargetscan12793485936623184265265miRanda12703451025789063055763Result126634437986331—

3 討 論

2013年，Rothman、Schekman和Sudhof對(duì)外泌體(EXO)運(yùn)輸調(diào)節(jié)機(jī)制的研究獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。自此，EXO成為研究熱點(diǎn)[18]。旋毛蟲是一種重要的食源性寄生蟲，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全，但關(guān)于旋毛蟲肌幼蟲期EXO的研究尚未報(bào)道[19]。目前分離EXO的方法很多，常用的有超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、超濾法等[20]。超速離心法是分離EXO的常用方法，已被廣泛應(yīng)用于各種EXO的分離，主要依據(jù)粒子密度和大小設(shè)置離心力，一般為高速離心和低速離心配合，可獲得較高純度的EXO，具有操作簡(jiǎn)單、不易污染等優(yōu)點(diǎn)，因此是EXO提取的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。我們通過超速離心法分離旋毛蟲肌幼蟲培養(yǎng)12h后的上清，在透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲肌幼蟲期外泌體(ML-EXO)呈球形，與EXO的經(jīng)典形態(tài)相似。納米顆粒追蹤技術(shù)原理是對(duì)每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行跟蹤和分析，結(jié)合Stockes-Einstein方程式計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度，該技術(shù)的樣本處理簡(jiǎn)單，能保證EXO原始狀態(tài)，檢測(cè)速度快，已成為鑒定EXO的方法之一[22]。采用納米顆粒追蹤技術(shù)檢測(cè)到ML-EXO直徑在80～200 nm之間。EXO的標(biāo)記物有CD9、CD63、CD81、Enolase等，其中CD63是一種保守的四聚體跨膜蛋白，直接參與了EXO內(nèi)容物的分選，Enolase則參與EXO的合成過程[23]。因此，本研究檢測(cè)了ML-EXO CD63和Enolase的表達(dá)，均為陽性。這些結(jié)果表明我們成功分離獲得了旋毛蟲肌幼蟲期EXO。

miRNA可以通過EXO從寄生蟲傳遞到宿主細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與寄生蟲與宿主的相互作用，因此，鑒定EXO中的miRNA為研究寄生蟲病的發(fā)病機(jī)制和藥物靶點(diǎn)開辟了新的途徑[24]。Let-7是蠕蟲中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)miRNA，同時(shí)也出現(xiàn)在寄生蟲EXO中，可下調(diào)宿主的免疫反應(yīng)，miRNA還與寄生蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，miR-277和miR-4989可通過介導(dǎo)信號(hào)通路參與血吸蟲的發(fā)育[25]。本研究通過targetscan和miRanda軟件，在ML-EXO中鑒定了1 266種miRNA。研究miRNA功能的前提是確定其靶基因，然而，由于互補(bǔ)的序列較少，使得對(duì)miRNA靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較低[26]。但是對(duì)miRNA與靶基因的研究發(fā)現(xiàn)它們的作用有一定規(guī)律，預(yù)測(cè)一個(gè)靶基因的決定因素為miRNA的5′端有6～8個(gè)核苷酸可以與靶基因mRNA的3′端精確互補(bǔ)，這6～8個(gè)核苷酸稱為“種子序列”[27]。因此，miRNA靶基因預(yù)測(cè)主要用種子序列的互補(bǔ)程度和miRNA與相應(yīng)靶基因結(jié)合的穩(wěn)定性作為基礎(chǔ)[28]?；谶@些原則，人們開發(fā)miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件有Targetscan、miRanda等[29]。Targetscan軟件基于miRNA的種子序列與靶基因序列互補(bǔ)，而miRanda軟件基于miRNA與相應(yīng)靶基因結(jié)合的穩(wěn)定性。因此，這些軟件的算法和側(cè)重點(diǎn)有區(qū)別，對(duì)預(yù)測(cè)同一個(gè)miRNA靶基因也有偏差[30]。所以，我們用Targetscan和miRanda軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，取交集作為預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明，miRNA的靶基因數(shù)量有34 437個(gè)，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。在miRNA靶基因的GO富集分析中，ML-EXO中miRNA的靶基因富集到細(xì)胞過程、生物學(xué)調(diào)節(jié)、代謝過程等過程中，這表明EXO中miRNA的靶基因在細(xì)胞過程、生物學(xué)調(diào)節(jié)、代謝過程中發(fā)揮重要作用。寄生蟲對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用是通過寄生蟲和宿主之間遺傳信息的傳遞形成的，因此，寄生蟲miRNA在調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，我們通過ggplot2分析，發(fā)現(xiàn)一些miRNA調(diào)節(jié)免疫相關(guān)的靶基因，可能是旋毛蟲逃避宿主免疫防御的重要機(jī)制，這將為旋毛蟲與宿主的相互作用提供新的思路。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了旋毛蟲肌幼蟲可分泌EXO，同時(shí)，證明了EXO中含有多種功能性小RNA，為旋毛蟲EXO分離提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為后續(xù)ML-EXO發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

利益沖突：無