百合固金湯止血活性及其促凝機制研究?

陳宏鵬 黃婉蘭 閆 珺 何俊冰△

（1.廣東省揭陽市人民醫(yī)院，廣東 揭陽 522000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150000）

百合固金湯是臨床常用的經(jīng)典方劑，多用于治療肺腎陰虛的咳喘，亦有醫(yī)家用其治療咯血，尤其是以肺陰虧虛或肺腎陰虛為主要病機的咯血，亦能取效［1-3］。既往有報道用于治療支氣管擴張、肺結(jié)核、肺癌等導(dǎo)致的咯血，均能發(fā)揮止血作用［4-7］，但其止血機制尚不明確。本研究選取小鼠肝臟出血以及斷尾出血模型，評價百合固金湯的止血作用，并探討其止血作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（28±2）g，由北京維通利華實驗動物中心提供［合格證號SCXK（京）2016-0006；批號190408276435］。實驗期間，所有動物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±2）℃和空氣相對濕度恒定（60±5）%。動物隨意進(jìn)食進(jìn)水，12 h明暗循環(huán)飼養(yǎng)。所有動物于實驗前12 h禁食不禁水。

1.2 試藥與儀器 戊巴比妥鈉，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司（批號F20160514，純度≥99%）；白眉蛇毒凝血酶，購自錦州奧鴻制藥有限公司（批號H20171206）；凝血酶原時間（PT），凝血酶時間（TT），血漿纖維蛋白原（FIB）和活化部分凝血活酶時間（APTT）試劑盒購自希森美康有限公司，批號分別為STG10101-62，STG10301-35，STY20401-13，ST20201-08）；枸櫞酸鈉購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司（批號20180530）；百合固金湯中所有中藥材購自北京仟草股份有限公司（百合20 g，熟地黃15 g，生地黃15 g，玄參15 g，白芍5 g，甘草5 g，麥冬20 g，貝母20 g，當(dāng)歸15 g，桔梗5 g）；稱取百合固金湯藥材130 g，加2 000 mL雙蒸水，100℃回流提取2次，每次1 h。合并提取液，減壓濃縮干燥。纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）ELISA試劑盒均購自上海將來實業(yè)有限公司。CP224C電子天平（北京奧豪斯儀器有限公司）；LG-PABER-Ⅰ型血小板聚集分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司）；CA-550全自動凝血分析儀（日本希斯美康）株式會社。

1.3 分組與給藥 在肝臟出血和剪尾出血模型實驗中，昆明種小鼠40只隨機分為5個實驗組，分別為生理鹽水組（10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液）、陽性藥組（0.67 KU/kg白眉蛇毒凝血酶）以及百合固金湯高劑量、中劑量、低劑量組（0.5，0.3，0.1 g/kg，注射量均為10 mL/kg），每組8只，皮下給藥。在止血作用機制研究中，同樣只數(shù)的昆明小鼠分為5個實驗組，分別為生理鹽水組（10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液）、陽性藥組（0.67 KU/kg白眉蛇毒凝血酶）以及百合固金湯高劑量、中劑量、低劑量組（0.5，0.3，0.1 g/kg，注射量均為10 mL/kg），每組8只，皮下給藥。

1.4 造模與指標(biāo)檢測 1）小鼠斷尾出血模型出血時間考察：依據(jù)文獻(xiàn)建立小鼠斷尾出血模型［8-9］。給藥2 h后，4%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，5組小鼠在距離其尾部尖端1 cm處剪斷。從血液自行溢出時開始計時，每隔30 s用濾紙吸去尾尖流出的血滴1次，直至無血液流出，至出血停止，將此段時間記為出血時間，同時記錄實驗結(jié)果。2）小鼠肝臟損傷出血模型出血時間考察：臟損傷出血模型參照文獻(xiàn)報道方法，給藥2 h后，4%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿腹部中線剪開腹腔，暴露全部肝臟。用注射器的針頭于小鼠肝左葉靠下部垂直進(jìn)針3 mm，制備小鼠肝臟損傷出血模型［10］。自取出針頭后開始計時，之后每隔30 s用裁剪好的濕濾紙片輕觸傷口，觀察是否有血跡流出。至濾紙片上無血跡出現(xiàn)，同時滿足30 s后傷口處依舊不出血，視為出血停止。記錄小鼠肝臟止血的時間，并進(jìn)行分析。3）凝血相關(guān)4項指標(biāo)檢測：各組小鼠給藥2 h后摘眼球取血，用含有3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管收集血樣。取血完成后，震搖離心管，使抗凝劑與血液混合均勻。血液靜置10 min后，3 000 r/mim離心10 min，取上層血漿檢測TT、APTT、PT以及FIB 4項指標(biāo)［11-13］。4）全血中血小板數(shù)目檢測：各組小鼠給藥2 h后，摘眼球取血150 μL，使其血液滴入EDTA抗凝管中，將血液與管中EDTA抗凝劑混合均勻，防止血液發(fā)生凝集。利用血小板聚集分析儀檢測血小板數(shù)目（PLT）［14］。5）纖溶系統(tǒng)t-PA，PAI-1的測定：各組小鼠給藥2 h后摘眼球取血，用含有3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管收集血液，震搖離心管。采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照各個試劑盒說明書操作步驟，測定血漿中反應(yīng)凝血系統(tǒng)狀態(tài)的t-PA和PAI-1的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0版統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間差異比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 百合固金湯對剪尾及肝損傷出血的止血作用 見表1。與生理鹽水組比較，陽性藥組，百合固金湯高劑量組、中劑量組、低劑量組均顯著縮短了小鼠經(jīng)斷尾后的尾尖出血時間及肝損傷時間，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組小鼠出血時間比較（min，±s）

表1 各組小鼠出血時間比較（min，±s）

與生理鹽水組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。下同

組別生理鹽水組陽性藥組百合固金湯高劑量組百合固金湯中劑量組百合固金湯低劑量組n 6 6 6 6 6尾尖出血時間23.27±2.92 2.69±1.12**8.18±0.87**10.11±2.93**15.77±4.07*肝損傷出血時間8.19±0.95 3.00±0.82**4.28±0.76**4.34±0.89**5.61±0.81*

2.2 百合固金湯對凝血相關(guān)指標(biāo)及血小板的影響見表2，表3。PT和TT值在各組之未發(fā)現(xiàn)差異。而與生理鹽水組相比，百合固金湯高劑量和中劑量干預(yù)顯著縮短了小鼠的APTT（P＜0.01）。同時，百合固金湯高劑量和中劑量干預(yù)顯著升高了小鼠血漿中的FIB含量（P＜0.01），低劑量組無明顯變化（P＞0.05）。百合固金湯高、中、低劑量給藥后均升高了小鼠血液中的血小板含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組小鼠凝血4項指標(biāo)比較（±s）

表2 各組小鼠凝血4項指標(biāo)比較（±s）

組別生理鹽水組陽性藥組百合固金湯高劑量組百合固金湯中劑量組百合固金湯低劑量組n 6 6 6 6 6 PT（s）15.50±0.77 15.21±0.65 14.86±0.45 15.2±0.67 15.01±0.43 TT（s）43.08±1.91 43.13±1.84 42.375±1.61 42.46±2.04 43.34±1.96 APTT（s）18.75±1.11 18.5±1.49 15.13±1.45**16.35±1.24**18.19±1.32 FIB（g/L）2.092±0.078 2.347±0.062**2.360±0.123**2.295±0.042**2.190±0.078

2.3 百合固金湯對纖溶系統(tǒng)測定的影響 見表4。與0.9%氯化鈉溶液組比較，百合固金湯高、中、低劑量時均具有顯著提高t-PA的活性的作用（P＜0.05），而對PAI-1的影響主要表現(xiàn)為降低（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血小板含量比較（g/L，±s）

表3 各組小鼠血小板含量比較（g/L，±s）

組別生理鹽水組陽性藥組百合固金湯高劑量組百合固金湯中劑量組百合固金湯低劑量組n 6 6 6 6 6 PLT 990.0±81.7 1 201.3±118.1**1 204.5±109.1**1 134.6±107.5*1 144.0±75.4*

表4 各組小鼠t-PA及PAI-1比較（±s）

表4 各組小鼠t-PA及PAI-1比較（±s）

組別生理鹽水組陽性藥組百合固金湯高劑量組百合固金湯中劑量組百合固金湯低劑量組n 6 6 6 6 6 t-PA（ng/mL）1.62±0.24 1.49±0.17 1.26±0.24*1.15±0.15*1.21±0.18*PAI-1（pg/mL）133.78±27.09 140.12±19.87 158.24±6.27*166.09±11.90*160.50±22.70*

3 討論

百合固金湯是明代周之干所著《慎齋遺書》中的經(jīng)典方劑，由熟地黃、生地黃、當(dāng)歸身（各三錢）、白芍、甘草（各一錢）、桔梗、元參（各八分）、貝母、麥冬、百合（各錢半）組成，用治“患背心前胸肺募間熱，咳嗽咽痛，咯血，惡寒，手大拇指循白肉際間上肩房至胸前如活烙”的病癥。明代羅周彥在《醫(yī)宗粹言》中進(jìn)一步闡釋道“此皆肺臟先天元陰衰弱，不能御火，以致虛火上炎為患，并以百合固金湯主之”。為百合固金湯治療肺陰虧虛導(dǎo)致的咯血的理論依據(jù)。陰虛血熱，迫血妄行，是陰虛咯血的病機根本，肺腎陰虧，肺失肅降，導(dǎo)致咳嗽，是咯血發(fā)生和加重的誘因。百合固金湯方中百合、麥冬、貝母養(yǎng)陰清熱，潤肺止咳，生地黃、熟地黃、玄參滋陰養(yǎng)血，白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝，桔梗載藥上行，甘草清熱瀉火，調(diào)和諸藥。全方金水同調(diào)，一方面補充陰液，滋陰以降火，使虛熱消，血方能歸肝，治療咯血的病機根本，另一方面，潤肺止咳，去除咯血的誘因，標(biāo)本同治，故能取效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前針對咯血主要以止血藥物對癥治療為主，必要時采取外科手術(shù)及介入治療?，F(xiàn)有常用的內(nèi)科治療藥物有安絡(luò)血、止血敏、止血芳酸等，上述藥物多通過影響血小板系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)發(fā)揮止血作用。

本研究結(jié)果提示，百合固金湯對小鼠血小板系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)亦有影響。PLT是從骨髓造血組織中成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解脫落下來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，具有黏附、聚集、釋放、收縮及吸附等生理特性，是凝血過程中是非常重要的一環(huán)［7］。PLT的活化、黏合性、釋放和聚集被認(rèn)為是血栓形成過程中的重要機制，而血小板計數(shù)是影響血小板聚集的重要因素之一［16］。止血藥大多是通過升高血小板數(shù)量或者是增強血小板的功效從而達(dá)到止血的效果。本實驗證實，百合固金湯給藥組能夠明顯升髙PLT的數(shù)量，從而進(jìn)一步佐證了其止血作用。

在研究凝血因子的過程中，可以通過TT、PT、APTT以及FIB推測藥物可能作用的凝血途徑［17］。凝血過程包括內(nèi)源性凝血通路（內(nèi)源性）和外源性凝血通路（外源性）。PT與外源性凝血通路的總效率相關(guān)，APTT與內(nèi)源性凝血指標(biāo)相關(guān)。同時，血漿中常見的凝血通路以及促進(jìn)纖維蛋白轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的活性與TT和FIB水平有關(guān)［18］。百合固金湯的止血機制研究結(jié)果表明，其能顯著降低APTT，而對PT和TT無影響，推測百合固金湯主要通過激活內(nèi)源性凝血通路從而達(dá)到止血效果。同時，本次研究還發(fā)現(xiàn)百合固金湯具有明顯的升高小鼠的FIB的作用，基于這一結(jié)果，我們進(jìn)一步探討了其對纖維蛋白溶解系統(tǒng)的作用。

纖維蛋白溶解系統(tǒng)在機體的凝血機制中扮演重要角色，其活性的主要指標(biāo)包括t-PA和PAI-1。t-PA為特異性激活劑，主要作用于組織型纖溶酶原。機體在形成纖維蛋白時，t-PA通過結(jié)合到纖維蛋白的表面從而催化促進(jìn)纖維蛋白溶解。PAI-1則是t-PA的特異性抑制劑，可以與細(xì)胞和血液中的t-PA結(jié)合，同時可以通過抑制t-PA從而使血漿纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。t-PA與PAI-1的動態(tài)平衡對機體的凝血系統(tǒng)具有重要的意義［19］。體內(nèi)的凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)聯(lián)系緊密、相互依存。本次實驗發(fā)現(xiàn)，百合固金湯可以顯著提高t-PA的活性，并且能夠降低PAI-1，從而影響纖溶系統(tǒng)發(fā)揮促凝血作用。這一結(jié)果表明百合固金湯的止血作用與提高纖溶系統(tǒng)的活性有關(guān)，從而闡釋了百合固金湯促凝過程與纖溶系統(tǒng)相關(guān)的機制，進(jìn)一步從分子水平上為百合固金湯的止血活性及其治療咯血機制提供理論依據(jù)。