補腎疏肝湯對慢性疲勞綜合征大鼠模型抗疲勞作用機制的實驗研究※

牛占忠 劉丁丁 岳 雁 張喜平

(滄州醫(yī)學高等?？茖W校針推教研室，河北 滄州 061001)

慢性疲勞綜合征是一組癥候群，以慢性疲勞為主要癥狀，常伴焦慮、抑郁、失眠、無固定部位的疼痛、不適、性功能低下、免疫力低下引起的類似感冒癥狀等表現(xiàn)。目前本病發(fā)病率極高，尤其是在大中城市，確切發(fā)病病因不明，嚴重影響人們的身體健康。有資料表明，慢性疲勞綜合征的發(fā)生與下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸調節(jié)過程出現(xiàn)異常相關，還與5-羥色胺(5-HT)功能低下有關[1-3]。還有研究表明，慢性疲勞綜合征的發(fā)生與自由基的代謝關系密切[4-5]。我們臨床應用補腎疏肝湯治療慢性疲勞綜合征取得了良好效果[6-7]。本實驗通過研究補腎疏肝湯對慢性疲勞綜合征大鼠模型抗疲勞的作用機制，為補腎疏肝湯治療慢性疲勞綜合征提供確切的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性健康SD大鼠50只，清潔級，體質量230～260 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)201520001。飼養(yǎng)動物環(huán)境：實驗室清潔飼養(yǎng)，溫度21～26 ℃，濕度50%左右，噪聲<60 dB，照明12 h明、12 h暗。

1.1.2 實驗藥物 補腎疏肝湯藥物組成：熟地黃20 g，淫羊藿10 g，枸杞子15 g，生地黃20 g，玄參15 g，麥冬15 g，當歸12 g，川芎10 g，柴胡10 g，枳殼10 g，黃芩12 g，黃連6 g，甘草6 g。按原方比例加重蒸水浸泡1 h后煎煮，武火煎開，文火繼續(xù)煎煮20 min，然后濾取藥液，藥渣再加重蒸水煎煮20 min后濾取藥液。2次所取藥液混合，濃縮至含生藥2 g/mL，滅菌密封備用。

1.1.3 實驗試劑 丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號:2015926)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號：20151012)、5-HT免疫組化試劑盒(批號：2015612)，均由南京建成生物工程研究所提供。大鼠過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(批號:20150413)、大鼠細胞色素C氧化酶(COX)ELISA試劑盒(批號:20150721)，均由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供。

1.1.4 實驗儀器 大鼠實驗泳缸(自制)、剝奪睡眠所用加鐵絲網(wǎng)的塑料盆(自制)、電子天平(上海英衡電子秤有限公司)、秒表(武漢雙龍旭光體育器材有限公司)、超聲波細胞粉碎儀(寧波唯誠超聲波設備科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將50只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為5組，即空白組、模型組及補腎疏肝湯低、中、高劑量組，各組均10只。

1.2.2 模型制備 采用文獻[8]中力竭游泳加剝奪睡眠20 h方法制備慢性疲勞綜合征模型。空白組大鼠不參加模型制備。每日9:00，讓除空白組外其他各組大鼠在自制的實驗泳缸中進行1次力竭游泳。泳缸長100 cm、寬40 cm、高60 cm。其中儲水深度50 cm，水溫(25±1) ℃。進行實驗前，先記錄大鼠體質量，并在大鼠尾巴根部綁縛相當于其體質量5%的負重鉛皮，然后將大鼠放入泳缸中進行負重游泳并開始計時。當大鼠達到力竭狀態(tài)(即大鼠游泳姿態(tài)失常，出現(xiàn)慌張表現(xiàn)，肢體動作失調，在水中活動范圍減小，經(jīng)常打圈，不能在大范圍內來回游動，甚至僅能在一個角落勉強保持鼻尖露出水面。或大鼠完全沉沒于水中，不能自行浮出達10 s),將其撈出，記錄游泳持續(xù)時間，即力竭游泳時間。并用毛巾將其身體擦干，用電熱風機吹干皮毛，將其放入鼠籠中休息，予正常飲食及水，保持環(huán)境溫度在21～26 ℃。當日13：00給予大鼠剝奪睡眠處理。將大鼠放入盛水的塑料盆中，水深1.5 cm，使大鼠不能安然入睡，然后用鐵絲網(wǎng)封固，防止大鼠逃脫。同時供應大鼠正常食物和水，持續(xù)至第2 d 9：00，進行下一周期的力竭游泳加剝奪睡眠20 h。每日1次，連續(xù)14 d。

1.2.3 給藥方法 在造模同時，空白組、模型組均予0.9%氯化鈉注射液40 mL/(kg·d)灌胃；補腎疏肝湯低、中、高劑量組分別予補腎疏肝湯40 mL/(kg·d)灌胃，其含生藥量分別為17.28、34.56、69.12 g/(kg·d)，分別相當于人體用量1、2、4倍。均連續(xù)灌胃14 d。

1.3 觀察指標及方法 ①比較各組大鼠第1 d首次、第14 d末次力竭游泳時間。②在大鼠第14 d末次力竭游泳后禁食24 h，0.03%水合氯醛腹腔麻醉后腹主動脈取血，應用比色法檢測血清MDA、SOD水平。③分離出大鼠全腦，去除兩側菱形突起，切取中央部分的下丘腦標本，用免疫組化法檢測5-HT含量。④快速取出各組大鼠后肢骨骼肌組織1塊，稱取1 g放入0.9%氯化鈉注射液中漂洗去血液，用濾紙拭干后，將組織加入適量0.9%氯化鈉注射液搗碎，3 000 r/min離心10 min，取上清液制成骨骼肌組織勻漿，分裝標號置于-20 ℃冰柜中保存。由專業(yè)人員按PGC-1α ELISA試劑盒說明書中的步驟檢測大鼠骨骼肌中PGC-1α含量。將取好的骨骼肌組織剪碎，移至預冷的玻璃勻漿器中，按照5 mL/g用量加入分離介質[pH=7.4，蔗糖0.25 mol/L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)0.005 mol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.001 mol/L]，上下勻漿30次，將勻漿液低溫1 200 r/min離心10 min，取其上清液；再用低溫超速12 000 r/min離心20 min，棄其上清液，其沉淀部分即為線粒體。加入2 mL分離介質，制成線粒體勻漿液，再用超聲波細胞粉碎儀打碎線粒體膜結構，制成線粒體懸浮液，分裝標號置于-20 ℃冰柜中保存。整個過程在0～4 ℃進行。按COX ELISA檢測試劑盒說明書中的步驟檢測大鼠骨骼肌中COX含量。

2 結 果

2.1 各組大鼠第1 d首次、第14 d末次力竭游泳時間比較 見表1。

組 別n第1 d首次力竭游泳時間第14 d末次力竭游泳時間空白組10__模型組10741.0±143.5496.0±94.6補腎疏肝湯低劑量組10729.0±197.4643.0±112.9?△#補腎疏肝湯中劑量組10746.0±157.8907.0±172.8?#補腎疏肝湯高劑量組10735.0±178.3719.0±101.2?△

與模型組比較，*P<0.05；與補腎疏肝湯中劑量組比較，△P<0.05；與本組第1 d首次力竭游泳時間比較，#P<0.05

由表1可見，補腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠第14 d末次力竭游泳時間均較模型組延長(P<0.05)，且補腎疏肝湯中劑量組大鼠第14 d末次力竭游泳時間最長(P<0.05)。補腎疏肝湯低劑量組第14 d末次力竭游泳時間較第1 d首次力竭游泳時間縮短(P<0.05)；補腎疏肝湯中劑量組第14 d末次力竭游泳時間較第1 d首次力竭游泳時間延長(P<0.05)。

2.2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較 見表2。

組 別nSOD(U/mL)MDA(nmol/mL)空白組10142.52±14.904.39±0.51模型組10114.84±8.32?7.79±0.80?補腎疏肝湯低劑量組10136.44±18.53△#4.54±0.66△#補腎疏肝湯中劑量組10172.97±16.38△3.46±0.56△補腎疏肝湯高劑量組10163.28±13.79△#5.98±0.61#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與補腎疏肝湯中劑量組比較，#P<0.05

由表2可見，模型組大鼠血清SOD水平低于空白組(P<0.05)，MDA水平高于空白組(P<0.05)。補腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠血清SOD水平均高于模型組(P<0.05)，補腎疏肝湯低、中劑量組大鼠MDA水平低于模型組(P<0.05)。補腎疏肝湯中劑量組大鼠血清SOD水平高于補腎疏肝湯低、高劑量組(P<0.05)，MDA水平低于補腎疏肝湯低、高劑量組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠下丘腦5-HT含量比較 見表3。

組 別n5-HT(pg/mL)空白組1012.82±1.73模型組109.18±1.47?補腎疏肝湯低劑量組109.44±1.53補腎疏肝湯中劑量組1011.97±2.03△補腎疏肝湯高劑量組1010.41±1.83△#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與補腎疏肝湯中劑量組比較，#P<0.05

由表3可見，模型組大鼠下丘腦5-HT含量低于空白組(P<0.05)。補腎疏肝湯中、高劑量組大鼠下丘腦5-HT含量均高于模型組(P<0.05)，且補腎疏肝湯中劑量組高于補腎疏肝湯高劑量組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量比較 見表4。

由表4可見，模型組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均低于空白組(P<0.05)。補腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均高于模型組(P<0.05)，且補腎疏肝湯中劑量組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量最高(P<0.05)。

組 別nPGC-1α(nmol/L)COX(nmol/mg)空白組10231.28±19.68120.89±9.86模型組10154.25±20.36?78.12±10.08?補腎疏肝湯低劑量組10179.22±18.75△#108.54±8.93△#補腎疏肝湯中劑量組10208.32±16.39△128.36±14.43△補腎疏肝湯高劑量組10192.45±17.96△#124.66±11.65△#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與補腎疏肝湯中劑量組比較，#P<0.05

3 討 論

中醫(yī)學認為，腎中元氣運行全身各處，以維持全身各臟腑、組織、器官的生理功能。元氣充足則全身各臟腑、組織、器官功能正常；元氣不足，則各臟腑、組織、器官功能低下。同時，腎中元氣通過肝的疏泄作用運行全身各處，肝的疏泄功能不正常，元氣不能通過經(jīng)絡流通到全身各處，各臟腑、組織、器官不能得到元氣充養(yǎng)而功能低下。這時，人就會出現(xiàn)慢性疲勞綜合征所表現(xiàn)出的癥狀，如疲勞、乏力、氣短、腰痠、煩躁、失眠、抑郁、焦慮、性功能低下等癥狀。故腎虛和肝郁是慢性疲勞綜合征發(fā)病的重要病機。補腎疏肝湯正是依據(jù)這一病機制定的方劑。方中熟地黃、淫羊藿、枸杞子、生地黃、玄參、麥冬滋陰壯陽，補助腎氣；當歸、川芎養(yǎng)血行血；柴胡、枳殼疏肝理氣；黃芩、黃連清肝郁之火。諸藥合用，起到補腎、疏肝的功效。

目前，慢性疲勞綜合征的發(fā)生機制尚不確切，認為氧自由基和脂質過氧化過程與疲勞的產(chǎn)生有著密切關系。氧自由基在脂質過氧化過程中起決定性作用，促進MDA生成。體內產(chǎn)生的MDA可使蛋白質性質發(fā)生變化，因為體內的酶由蛋白質構成，所以MDA可使一些酶發(fā)生變性，失去應有的活性。大量氧自由基對細胞內線粒體及其他細胞器造成損傷，從而促進細胞衰老、凋亡[9-10]，使機體組織器官功能低下，產(chǎn)生疲勞。所以MDA可作為衡量機體細胞功能損傷的一個指標，間接反映機體疲勞狀態(tài)。同時，氧自由基的生成過程也受到一定限制。氧自由基的產(chǎn)生可被機體內某些抗氧化劑或抗氧化酶阻止，抗氧化劑和抗氧化酶間接起到了保護細胞免受損傷的作用。比如機體細胞中的SOD可催化超氧陰離子歧化為過氧化氫(H2O2)和氧(O2)，進而清除氧自由基，使機體細胞免受氧自由基的損傷。當機體內抗氧化劑和抗氧化酶不足時，細胞損傷加重。當抗氧化劑和抗氧化酶被消耗完后，細胞線粒體受到損傷，出現(xiàn)功能障礙，影響細胞代謝，導致細胞凋亡，使機體組織損傷，功能低下。本研究結果顯示，補腎疏肝湯可使慢性疲勞綜合征大鼠血清SOD升高，MDA下降。說明補腎疏肝湯通過增強機體自身抗氧化酶活性，進而提高自身抗氧化能力，提高清除體內氧自由基，減少氧自由基對機體的損傷，而起到消除疲勞的作用。

慢性疲勞綜合征的產(chǎn)生與內分泌系統(tǒng)關系密切，內分泌紊亂是慢性疲勞綜合征形成的基礎之一。機體內分泌系統(tǒng)由下丘腦控制。HPA軸是內分泌系統(tǒng)的通路，由下丘腦控制，其功能紊亂可導致疲勞產(chǎn)生。常見的單胺類遞質如多巴胺、5-HT等對HPA軸的調控有重要作用，與人體的許多生理活動關系密切。當下丘腦5-HT含量充足，機體處于興奮狀態(tài)時，人表現(xiàn)為情緒高漲，思維敏捷，動作精準、有力，意志力堅定，飲食、睡眠正常。當下丘腦5-HT含量不足時，人體處于抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為疲勞[11-12]。所以，下丘腦5-HT含量可反映機體慢性疲勞狀態(tài)。本研究結果顯示，補腎疏肝湯中、高劑量組大鼠下丘腦5-HT水平均高于模型組(P<0.05)，提示補腎疏肝湯可能通過調節(jié)5-HT回歸正常水平，進而調節(jié)HPA軸來緩解大鼠的慢性疲勞。

有研究表明，PGC-1α是一個轉錄激活因子，它在機體組織中分布具有特異性，在需要提供比較多能量的組織中分布較多，而在需要能量較少的組織中分布較少[13]。在機體需要提供比較多能量的組織如心肌、骨骼肌中分布最多。PGC-1α參與機體內很多代謝過程。線粒體是細胞生產(chǎn)能量的場所，在線粒體中，細胞通過氧化磷酸過程生成大量腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，ATP是機體生命活動的基本物質，為機體各種生理活動提供能量。PGC-1α能調控線粒體在體內的合成。在機體需要大量能量時，PGC-1α可調控細胞產(chǎn)生大量線粒體，并且可誘導線粒體產(chǎn)生大量ATP[14]。此外，PGC-1α蛋白可使機體增加Ⅰ型肌纖維的比例。Ⅰ型肌纖維含有更多的線粒體，在機體耗氧量增多時可提供更多能量。所以，機體中Ⅰ型肌纖維的含量比例高是抗疲勞能力高的標志。骨骼肌中PGC-1α的含量間接反映了機體對抗疲勞的能力，因此骨骼肌中PGC-1α含量可作為衡量機體抗疲勞的指標。COX是細胞器線粒體上的一種氧化還原酶，也是線粒體上具有標志意義的酶，線粒體的氧化呼吸依靠它來完成。COX可催化還原型細胞色素C氧化，通過此反應實現(xiàn)細胞的氧化磷酸化過程，產(chǎn)生能為細胞、組織提供能量的ATP[15]。所以，線粒體中COX活性與線粒體產(chǎn)生的能量關系密切，機體骨骼肌中COX含量的增高提示機體內能量產(chǎn)生增多，也反映了機體抗疲勞能力增強。本研究結果表明，補腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均高于模型組(P<0.05)，說明補腎疏肝湯低、中、高劑量組均可提高機體骨骼肌中PGC-1α、COX的含量，具有抗疲勞作用。

在慢性疲勞的動物實驗中，體能測定是判斷動物抗疲勞的指標之一，而力竭游泳時間是反映體能的直觀指標。本研究結果表明，補腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠第14 d末次力竭游泳時間均較模型組延長(P<0.05)，說明補腎疏肝湯可以增加疲勞大鼠力竭游泳時間，增強大鼠體力，具有抗疲勞作用，而補腎疏肝湯中劑量組作用更明顯(P<0.05)。

綜上所述，補腎疏肝湯對慢性疲勞綜合征大鼠模型具有抗疲勞作用，效果確切,根據(jù)實驗數(shù)據(jù)觀察，補腎疏肝湯中劑量組更值得臨床研究。