雷替曲塞對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

賀許良，黃英，曾良玉，易小龍，李文俊，張樹友

1長沙醫(yī)學(xué)院附屬株洲市人民醫(yī)院，湖南株洲 412000；2南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院

結(jié)直腸癌是消化道的常見惡性腫瘤，且隨著人們生活水平的不斷提高和飲食習(xí)慣的改變，近年其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[1,2]。2017年美國癌癥協(xié)會數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第三[3]。目前，臨床上治療此類疾病最直接有效的方法仍以手術(shù)為主[4,5]，但患者術(shù)后5年生存率僅為65%[6]，且不僅復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高，對中晚期患者的治療效果也較差[7]。為提高此類患者的治療效果，化療仍是主要的輔助治療手段。雷替曲塞作為一種特異性胸苷酸合成酶(TS)抑制劑能夠選擇性抑制TS，從而對抗腫瘤細(xì)胞的增殖，近年被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的輔助治療[8～11]，但其對結(jié)直腸癌細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。2017年6月～2019年6月，本研究觀察了雷替曲塞對人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)增殖、凋亡的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SW480購自上海一研生物科技有限公司；雷替曲塞(2 mg/支，批號H20090325)購自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基(批號350-000-CL)、胎牛血清(批號086150013)購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；兔抗人Bax(批號20151209)、Bcl-2(批號20140608)及Caspase-3單克隆抗體(批號20130908)購自美國ABcam公司；胰蛋白酶、PBS、CCK-8試劑盒、RIPA蛋白裂解液等由碧云天生物技術(shù)研究所配制；羊抗兔β-actin內(nèi)參、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、ECL發(fā)光檢測試劑盒等購自南京凱基生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成；細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺購自上海成永實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；4 ℃低溫高速離心機(jī)購自德國Beckman公司；自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀、流式細(xì)胞儀等購自美國Bio Tek儀器有限公司；RT-PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) ①細(xì)胞復(fù)蘇：超凈工作臺臺面于紫外線照射30 min 后，將SW480凍存管迅速從液氮罐中取出，并置于37 ℃水浴箱中進(jìn)行解凍。融化后取出凍存管，并用75%乙醇棉球擦拭其外壁。用移液槍吹打細(xì)胞液分散細(xì)胞后，用吸管吸出細(xì)胞液置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中混勻，放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%左右且生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄掉培養(yǎng)液，加入PBS溶液反復(fù)沖洗后，加入胰蛋白酶500 μL，待顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、亮度增加且出現(xiàn)明顯細(xì)胞間隙時(shí)吸去胰酶，加入10%胎牛血清終止消化。再次吹打至細(xì)胞形成懸液后，加入培養(yǎng)液并按1∶3的比例進(jìn)行分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。③細(xì)胞凍存：待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液1 d后，按上述細(xì)胞傳代方式進(jìn)行細(xì)胞消化，消化結(jié)束后取細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入凍存液，分裝至凍存管中，注明細(xì)胞種類、代系及凍存時(shí)間，分別放入4 ℃冰箱2 h、-20 ℃冰箱3 h、-80 ℃冰箱過夜后置入液氮罐中保存。

1.3 細(xì)胞分組 將SW480隨機(jī)分為A組、B組、C組與對照組，0.25%胰蛋白酶消化并于培養(yǎng)液中重新形成單細(xì)胞懸液后置于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)(每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔)，其中A組SW480培養(yǎng)液中加入0.1 μg/mL雷替曲塞,B組SW480培養(yǎng)液中加入0.5 μg/mL雷替曲塞,C組SW480培養(yǎng)液中加入2.5 μg/mL雷替曲塞,對照組單純加入等量培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞增殖檢測 分別取孵育24、48、72 h各組SW480，采用CCK-8試劑盒嚴(yán)格按說明書操作流程檢測細(xì)胞增殖活性，并用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度(OD)值，每組重復(fù)測定5次取平均值，以O(shè)D值表示相對細(xì)胞增殖活性。

1.5 克隆情況觀察 將6孔板內(nèi)貼壁生長的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)10 d，采用PBS清洗后，用10%的甲醛固定10 min，行吉姆薩染色；染色后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆情況，并對>50個(gè)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后計(jì)算克隆形成率(每組重復(fù)測定5次取平均值)?？寺⌒纬陕?%)=細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。細(xì)胞孵育72 h后取出6孔板，棄去培養(yǎng)基，加入TRIzol Regent，吹打至細(xì)胞全部裂解并靜置5 min后加入0.2 mL氯仿作用3 min； 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上層清液加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄去上層清液；加入75%乙醇1 mL混勻后4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄去上層清液，風(fēng)干10 min；加入DEPC水20 μL，55 ℃金屬浴10 min；提取樣品分別檢測其在260 nm及280 nm波長吸光度(A)值，A260/A280值在1.8～2.0視為RNA提取合格；在冰上按照順序?qū)NA、Oligo(dT)18引物、DEPC水、Reaction Buffer等加入PCR管中混勻后42 ℃恒溫孵育60 min、70 ℃恒溫孵育5 min；準(zhǔn)備PCR 板，配置總體積為5 μL的反應(yīng)體系(其中上游和下游引物各10 pmol)，95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s預(yù)變性40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量(每組重復(fù)測定5次取平均值)。

1.7 細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白檢測 采用Western Blotting法。細(xì)胞孵育72 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，采用PBS沖洗3次，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液裂解、混勻，并冰浴15 min；冰浴后，依次勻漿，12 000 r/min離心15 min；提取總蛋白，采用紫外分光光度計(jì)測定總蛋白濃度，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取蛋白上樣與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻后100 ℃加熱10 min進(jìn)行蛋白變性，置于-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE凝膠制作后加入等體積蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，置于4 ℃環(huán)境下孵育一抗過夜；一抗孵育后，PBST洗膜3次，然后加入二抗，室溫下孵育60 min；二抗孵育后，PBST洗膜3次，并曝光顯影；最后用圖像分析軟件Image J檢測蛋白條帶灰度值(每組重復(fù)測定5次取平均值)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞孵育不同時(shí)間OD值比較

注：與本組24 h相比，aP<0.05；與對照組同時(shí)點(diǎn)相比，bP<0.05；與A組同時(shí)點(diǎn)相比，cP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞克隆形成率比較 細(xì)胞孵育10 d后，對照組、A組、B組、C組SW480克隆形成率分別為(81.03±5.32)%、(45.83±4.28)%、(31.05±3.75)%、(22.99±2.63)%，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 隨著雷替曲塞濃度的增加，SW480 Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，詳見表2。

2.4 各組細(xì)胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)比較 隨著雷替曲塞濃度的增加，SW480 Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，詳見圖1，表3。

表2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表達(dá)比較

注： 與對照組相比，aP<0.05；與A組相比，bP<0.05；與B組相比，cP<0.05。

圖1 各組Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)條帶圖

表3 各組細(xì)胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注： 與對照組相比，aP<0.05；與A組相比，bP<0.05；與B組相比，cP<0.05。

3 討論

流行病學(xué)研究顯示，全球每年新發(fā)結(jié)直腸癌病例高達(dá)93萬，嚴(yán)重威脅人類健康，且大部分患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已存在轉(zhuǎn)移，采取手術(shù)治療一般很難根治，必須采取化療的方法延長患者的生存期[12，13]。雷替曲塞作為一種抗代謝藥物，因其副作用較小、效果顯著,被廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的輔助治療，但有關(guān)其具體作用機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)較少。

腫瘤細(xì)胞的增殖及克隆形成反映了細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的強(qiáng)弱[14]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，雷替曲塞可將胃癌細(xì)胞S期的比例上升，從而將細(xì)胞進(jìn)程阻滯在G0/G1期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并且明顯抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803裸鼠移植瘤生長[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著雷替曲塞濃度的增加以及干預(yù)時(shí)間的延長,SW480的增殖速度減慢，且在濃度達(dá)到一定程度后，該現(xiàn)象不再明顯。此外，不同濃度的雷替曲塞對SW480癌細(xì)胞株的增殖和克隆體形成影響不同，克隆形成率隨雷替曲塞濃度的增加依次減少。

細(xì)胞凋亡的過程可概括為凋亡誘導(dǎo)、調(diào)控執(zhí)行及效應(yīng)三個(gè)階段。研究顯示，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與線粒體、死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密切相關(guān)[16]。如啟動(dòng)型Caspase可結(jié)合特異輔助因子，激活效應(yīng)型下游Caspase，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆性死亡[17]；位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上的Bcl-2蛋白，作為Caspase-3的直接作用底物，可被其裂解為促凋亡功能片段，從而瀑布樣促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[18]。周正等[19]發(fā)現(xiàn)，SH2B1在肝癌細(xì)胞株HepG2中高表達(dá)，沉默SH2B1表達(dá)可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞生長速度。張九成等[20]研發(fā)發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A作用于人結(jié)腸癌HCT116和SW480細(xì)胞，能顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白活化片段Cleaved-Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，隨著甘草查爾酮A濃度及時(shí)間的延長，人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制率增大，呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，可能的作用機(jī)制為激活氧化應(yīng)激和調(diào)控Bcl-2、Bax與Caspase-3信號通路。封革等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雷替曲塞干預(yù)微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(MSI-H)結(jié)腸癌細(xì)胞株后，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax等的表達(dá)明顯增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低。本研究結(jié)果顯示，隨著雷替曲塞濃度的增加，Bax及Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述，雷替曲塞可通過調(diào)節(jié)SW480 Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白及其mRNA的表達(dá)激活細(xì)胞凋亡通道，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，這將為臨床治療提供重要理論依據(jù)，其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。